学术研究报告：噬菌体编码的新型解聚酶K57-Dpo8特异性降解肺炎克雷伯菌K57型荚膜多糖的发现与研究

第一作者及研究机构
本研究由上海交通大学医学院免疫与微生物学系的Lun Heyuan（第一作者）、Wang Juanjuan（共同第一作者）及He Ping（通讯作者）领衔，联合上海润诺生物科技有限公司、苏州大学及浙江大学医学院附属浙江医院等机构合作完成。研究成果发表于2025年的开放获取期刊*One Health Advances*（卷3，第7期），遵循知识共享署名4.0国际许可协议。

学术背景

研究领域与动机
肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*）是革兰阴性条件致病菌，尤其高毒力（hypervirulent, hvKP）及多重耐药（multidrug-resistant, MDR）菌株的流行对全球公共卫生构成严重威胁。荚膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）是其主要毒力因子，可抵抗宿主免疫清除（如巨噬细胞吞噬和补体杀伤）。K57型荚膜与亚洲地区化脓性肝脓肿等高侵袭性感染密切相关，且部分菌株已出现碳青霉烯类耐药性。噬菌体解聚酶（depolymerase）能特异性降解CPS，为治疗hvKP和MDR感染提供潜在替代方案。

研究目标
本研究旨在从噬菌体p5054中鉴定一种新型K57型CPS解聚酶（K57-Dpo8），评估其体外和体内抗感染效果，并探索其在生物膜（biofilm）抑制及临床分型中的应用价值。

研究流程与方法

1. 噬菌体p5054的分离与特性分析

• 样本来源：从上海交通大学附属瑞金医院ICU患者痰液中分离的肺炎克雷伯菌8665株（K57型）作为宿主菌，通过医院污水共培养法获得噬菌体p5054。
  
• 形态学验证：双层琼脂平板实验显示噬菌体形成透明斑块并伴随晕圈（halo），提示存在解聚酶活性。
  
• 宿主谱测定：通过点斑试验（spot test）验证p5054仅感染16株测试菌中的K57型菌株（表1），且对荚膜合成基因*wbap*敲除株（8665δwbap）无活性（图1b）。
  

2. 噬菌体基因组分析与解聚酶鉴定

• 基因组测序：Illumina HiSeq 3000平台测序，组装获得39,590 bp基因组（NCBI登录号PQ133610），GC含量53.04%，预测50个开放阅读框（ORFs）。
  
• 解聚酶定位：通过BLASTp和HHpred预测ORF8（K57-Dpo8）为尾部纤维蛋白，具有β-螺旋结构（pectate lyase domain），与已知K57解聚酶Dep_Kpv79/767的氨基酸相似性分别为59.03%和71.26%（图2）。
  
• 结构建模：AlphaFold3和Swiss-Model预测K57-Dpo8的活性位点为Ala193和Pro220（图2d）。
  

3. K57-Dpo8的表达与功能验证

• 蛋白纯化：ORF8克隆至pET24a载体，在大肠杆菌BL21中表达，镍柱纯化获得63 kDa蛋白（图3a）。
  
• 解聚活性：
  
  • 斑点试验：最低有效浓度7.5 μg/mL可降解K57型CPS（图3b）。
    
  • SEC-HPLC分析：75 μg/mL K57-Dpo8在30分钟内完全降解CPS（图3c）。
    
  • 特异性验证：仅对K57型菌株产生晕圈，阴性对照K64-ORF41无活性（表1）。
    

4. 免疫增强与体内外疗效评估

• 血清杀菌实验：K57-Dpo8预处理使K57型菌株在75%兔血清中的存活率显著降低（图4a）。
  
• 巨噬细胞吞噬：RAW264.7细胞对K57-Dpo8处理菌的吞噬效率提升2倍（p<0.0001，图4b）。
  
• 小鼠感染模型：腹腔注射50 μg K57-Dpo8使感染K57型菌的小鼠存活率提高至60%（对照组48小时内全部死亡，图4c）。
  

5. 生物膜抑制与降解

• 抑制实验：10 μg/mL K57-Dpo8处理48小时显著减少生物膜形成（图5a）。
  
• 降解实验：对成熟生物膜的降解率达显著水平（p<0.01，图5b）。
  

主要结果与逻辑关联

1. 噬菌体特异性：p5054的严格宿主范围（仅K57型）为后续解聚酶靶向性研究奠定基础。
   
2. 结构-功能关系：K57-Dpo8的β-螺旋结构及活性位点预测通过生信分析与实验验证相互印证。
   
3. 治疗潜力：体外血清杀菌和巨噬细胞吞噬增强的结果，直接支持其在动物模型中的保护效果。
   
4. 应用扩展：生物膜抑制与降解能力为临床难治性感染（如导管相关感染）提供新策略。
   

结论与价值

1. 科学价值：首次报道噬菌体p5054及其解聚酶K57-Dpo8，阐明其结构基础和作用机制。
   
2. 应用价值：
   
   • 治疗替代：针对碳青霉烯耐药K57型菌株的潜在疗法。
     
   • 分型工具：比*wzi*基因分型更直接检测完整荚膜，适用于临床监测。
     
3. 创新点：
   
   • 发现新型K57解聚酶，拓展了噬菌体酶的多样性。
     
   • 综合评估解聚酶在免疫调节、生物膜干预及动物模型中的多效性。
     

研究亮点

1. 高特异性：K57-Dpo8对K57型CPS的降解活性严格且高效。
   
2. 多模型验证：从分子机制（结构预测）到临床应用（小鼠存活率）的全链条证据。
   
3. 跨学科方法：结合基因组学、蛋白质结构模拟、免疫学及感染模型。
   

其他价值
研究数据（噬菌体基因组PQ133610）及实验细节公开，为后续开发噬菌体鸡尾酒疗法或工程化酶提供基础。