基于氧化石墨烯的多靶标适配体高效筛选技术研究
作者及发表信息
本研究由韩国大学生命科学与生物技术学院的Van-Thuan Nguyen、Young Seop Kwon、Jae Hoon Kim和Man Bock Gu*共同完成，成果发表于《Chemical Communications》（Chem. Commun.）2014年第50卷，页码10513–10516。研究得到韩国农业食品农村事务部先进生产技术发展项目及韩国国家研究基金会（NRF）的资助。
学术背景与研究目标
农药在农业生产中广泛应用，但其残留对环境和人类健康构成严重威胁，如致癌性、神经毒性等。传统检测方法存在成本高、耗时长等问题，而基于核酸适配体（aptamer）的检测技术因其高亲和力、稳定性和可化学合成等优势成为研究热点。然而，传统SELEX（指数富集配体系统进化）技术存在效率低、适配体质量不稳定等缺陷。本研究提出了一种新型“多靶标GO-SELEX”（multi-GO-SELEX）方法，利用氧化石墨烯（graphene oxide, GO）无需固定靶标的特性，高效筛选能同时结合多种农药分子的“柔性适配体”（flexible aptamer），旨在开发快速、低成本的多靶标检测技术。
研究流程与方法
1. 实验设计与流程
- 靶标选择：选取三类农药——植物生长调节剂戊唑醇（tebuconazole）、杀菌剂稻瘟酰胺（inabenfide）和除草剂苯噻酰草胺（mefenacet）作为目标分子。
- 多靶标GO-SELEX流程：
- 第一步：反向筛选（counter-SELEX）：将6种非目标分子（counter targets）与单链DNA（ssDNA）随机文库混合，通过GO吸附去除非特异性结合的ssDNA，减少假阳性。
- 第二步：多靶标共孵育：将剩余ssDNA与GO结合后，加入三种农药混合物（各200 pmol），目标结合的ssDNA因构象变化从GO表面解离，经PCR扩增和PAGE纯化后进入下一轮筛选。
- 迭代筛选：前三轮针对混合靶标，后两轮针对单一靶标分别筛选。结果显示，ssDNA回收率从第1轮的4.3%提升至第3轮的63%，第4轮因靶标分离降至29%，最终在第5轮达到饱和。
主要研究结果
1. 特异性适配体筛选：成功获得10种ssDNA适配体，其中3种对单一靶标具有高特异性（如T1结合戊唑醇，T3结合稻瘟酰胺）。
2. 柔性适配体的发现：
- 适配体T2可同时结合三种农药，T3可结合两种。通过Au-NP比色实验证实，其结合能力随靶标浓度增加而增强（图5）。例如，T2在三种靶标共存时吸光度比值（A650/A520）从单靶标的2.9升至6.8。
- 圆二色谱（CD）分析显示，柔性适配体T2与不同靶标结合时呈现相似的构象变化，证实其多靶标结合能力源于动态构象调整。
3. 检测灵敏度：比色法检测限达128 nM（戊唑醇）、276 nM（苯噻酰草胺）和191 nM（稻瘟酰胺），适用于环境样本的快速筛查。
结论与价值
1. 科学意义：首次提出“多靶标GO-SELEX”策略，突破了传统SELEX仅能筛选单一靶标适配体的局限，为多靶标检测提供了新思路。
2. 应用价值：柔性适配体可简化检测流程，降低开发成本，在农药残留监测、食品安全及环境毒理学领域具有广泛应用潜力。
研究亮点
1. 方法创新：无需靶标固定化，利用GO的通用吸附特性实现高通量筛选，显著缩短实验周期（仅需5轮筛选）。
2. 理论突破：发现适配体的“柔性结合”现象，揭示了其通过构象动态调整实现多靶标识别的机制。
3. 技术整合：结合比色法与ITC，双重验证适配体性能，确保数据可靠性。
其他重要发现
- 研究还发现，56-mer和76-mer的ssDNA均可作为适配体候选，表明序列长度对多靶标结合能力的影响较小。
- 通过反向筛选和严格的特异性验证（如使用scrambled序列对照），排除了非特异性结合的干扰，增强了结论的可信度。
本研究为适配体技术在复杂小分子检测中的实际应用提供了重要技术支撑，未来可扩展至其他多靶标体系的快速筛查。