本研究由Yeh Chwan Leong、Valentina Di Foggia、Hema Pramod、Maria Bitner-Glindzicz、Aara Patel和Jane C. Sowden共同完成，研究团队来自英国伦敦大学学院（University College London）及其附属机构。研究成果发表于2022年11月的《Stem Cell Reports》期刊，标题为”Molecular pathology of Usher 1B patient-derived retinal organoids at single-cell resolution”。

学术背景

Usher综合征（Usher syndrome）是最常见的导致聋盲症的遗传性疾病，新生儿发病率约为1/25,000至4/25,000。该综合征分为三种主要临床类型（I-III型），其中USH1B亚型由MYO7A基因突变引起，占所有USH1病例的40%-55%。USH1B患者表现为先天性重度听力损失、平衡障碍和视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）。虽然人工耳蜗可以改善听力障碍，但目前尚无针对USH1B-RP的有效治疗方法。

MYO7A编码一种VII型肌球蛋白，在光感受器细胞中参与视紫红质（rhodopsin）从内节（inner segment, IS）向外节（outer segment, OS）的运输。然而，现有的动物模型（如shaker1小鼠）虽能模拟听力损失和平衡功能障碍，却无法重现USH1B的视网膜表型。这种局限性促使研究者开发更接近人类疾病的新模型。

研究流程

1. 患者来源iPSCs的建立： 研究团队从三名USH1B患者获取皮肤成纤维细胞，通过仙台病毒重编程获得诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。通过Sanger测序确认iPSCs携带与患者相同的MYO7A突变：患者1（USH1B.1）携带c.1996C>T（p.Arg666*）无义突变和剪接位点突变c.133-2A>G；患者2和3（USH1B.2和USH1B.3）携带c.6070C>T（p.Arg2024*）无义突变和c.223G>C（p.Asp75His）错义突变。

2. 3D视网膜类器官分化： 采用已发表的视网膜分化方案，将iPSCs分化为3D视网膜类器官。分化过程包括：第0天形成拟胚体（embryoid body），第2天转换为神经诱导培养基（neural induction medium），随后使用含不同补充剂的视网膜分化培养基（retinal differentiation medium）促进视网膜成熟。类器官培养至35周，定期取样进行形态学和分子特征分析。

3. 类器官表征：

   • 免疫组化（IHC）显示21周类器官已形成分层神经上皮，包含外核层（outer nuclear layer, ONL，光感受器细胞）、内核层（inner nuclear layer, INL，双极细胞等）和节细胞层（ganglion cell layer, GCL）。
   • 透射电镜（TEM）证实类器官具有光感受器亚细胞结构，如连接纤毛（connecting cilium）、线粒体丰富的内节和发育中的外节。
   • 35周类器官表达成熟光感受器标记物（RCVRN、CRX）、视杆细胞标记物（NRL、RHO）和视锥细胞标记物（ARR3、L/M-opsin）。

4. 转录组分析：

   • 批量RNA测序（bulk RNA-seq）分析不同时间点（0天、7周、14周、28周）的类器官，并与人类胎儿（20周）和成人视网膜比较。主成分分析（PCA）显示28周类器官转录组更接近胎儿视网膜。
   • 差异表达分析发现USH1B与对照类器官的差异基因数量随时间增加（7周803个，28周9,184个）。基因本体（GO）富集分析显示早期差异基因与线粒体功能相关，后期则富集于泛素-蛋白酶体系统和RNA剪接通路。

5. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）： 对35周类器官的39,934个单细胞进行测序，鉴定出25个细胞簇，涵盖7种主要视网膜细胞类型。MYO7A在Müller细胞（MCs）、双极细胞（BCs）、视杆细胞和视锥细胞中均有表达。差异表达分析发现：

   • USH1B视杆细胞（NRL+）中207个差异基因富集于氧化应激反应通路（如PRDX1、PRDX2、SOD1）。
   • USH1B Müller细胞（VIM+）中255个差异基因富集于凋亡信号通路。

主要结果

1. 类器官模型验证： USH1B类器官与对照在形态、分层结构和光感受器标记物表达上无显著差异，且未观察到明显的ONL变薄或光感受器死亡。这表明类器官模拟了USH1B-RP的早期阶段（儿童期发病前）。

2. 分子病理特征：

   • 批量RNA-seq揭示USH1B类器官随时间出现进行性转录组紊乱，与MYO7A表达增加同步。线粒体功能相关基因的早期失调提示代谢异常可能是疾病起始因素。
   • 后期差异基因涉及泛素-蛋白酶体系统（如TOPORs、UBR1）和RNA剪接（如PRPF18、PRPF31），这些通路异常与多种视网膜变性相关。

3. 单细胞水平的应激反应：

   • USH1B视杆细胞上调抗氧化酶（PRDXs、SOD1）和促凋亡因子（BNIP3），表明为抵抗氧化应激启动了防御机制。
   • Müller细胞凋亡通路激活可能反映其对邻近光感受器应激的反应，这与临床观察到的视网膜内界膜增厚现象一致。

结论与意义

本研究首次建立了USH1B患者来源的3D视网膜类器官模型，填补了该疾病缺乏可靠人类模型的空白。通过多组学分析，揭示了MYO7A突变导致的渐进性分子病理：从早期线粒体功能障碍到后期蛋白稳态失衡和RNA加工异常。单细胞分辨率数据首次发现MYO7A在Müller细胞中的表达及其可能的病理贡献，为理解USH1B-RP的细胞特异性 vulnerability提供了新视角。

研究亮点

1. 模型创新性：首个USH1B人源视网膜类器官模型，克服了动物模型无法重现视网膜表型的局限。
2. 技术先进性：结合批量RNA-seq和scRNA-seq，系统解析疾病进展中的时空转录组变化。
3. 发现重要性：
   • 鉴定出视杆细胞特异性应激反应和Müller细胞凋亡通路激活，提示细胞间互作在疾病中的作用。
   • 发现MYO7A在非光感受器细胞（如Müller细胞）中的表达，拓展了对该基因功能的认识。

其他价值

本研究建立的类器官平台可用于测试潜在治疗策略（如基因校正、抗氧化剂）。发现的早期分子标志物（如线粒体相关基因）可能作为疾病进展的生物标志物。此外，研究揭示的泛素-蛋白酶体系统和RNA剪接通路异常为开发靶向疗法提供了新思路。