本研究由Amanda C Walls等人完成，主要作者来自美国阿肯色大学（University of Arkansas）生物医学工程系，合作者包括荷兰埃因霍温理工大学（Eindhoven University of Technology）的研究人员。论文发表于《Biofabrication》期刊，2024年8月13日正式刊登，论文编号为16卷045021。该研究属于生物制造（biofabrication）与器官芯片（organ-on-chip）领域，重点探讨鼻腔气道上皮细胞在气液界面（air-liquid interface, ALI）成熟过程中受到气流预处理（airflow pre-conditioning）的影响。

研究的学术背景建立在鼻黏膜作为呼吸道第一道防线的重要性之上。鼻黏膜由假复层上皮组成，主要包括纤毛细胞、非纤毛上皮细胞和杯状细胞（goblet cells）。杯状细胞分泌黏液捕获空气中的病原体，纤毛通过摆动将污染的黏液排出气道，这一过程称为黏液纤毛清除（mucociliary clearance）。体外构建鼻腔上皮模型时，细胞需要在气液界面培养至少20天才能从基底细胞分化为成熟的上皮细胞类型。已有研究表明，气流引起的壁面剪切应力（wall shear stress, WSS）会影响黏液产生、纤毛清除功能和炎症反应。然而，在体内基底细胞是在持续气流环境下不断分化以补充上皮层的，而在体外大多数模型只在细胞分化完成后才施加气流，这忽略了气流可能对分化过程本身的影响。因此，本研究旨在开发一种生理相关的鼻腔气道芯片（nasal airway-on-chip）模型，探究在气液界面成熟过程中施加气流预处理对上皮细胞形态、黏液分泌和炎症反应的影响。

研究的工作流程包括芯片设计与验证、细胞培养、气流施加方案、以及多项功能表征。芯片设计基于雷诺数（Reynolds number）、沃默斯利数（Womersley number）和斯特劳哈尔数（Strouhal number）三个无量纲数，以模拟正常呼吸时鼻腔内的层流和脉动特性。芯片气道截面为8 mm×8 mm，长度50 mm，由计算机数控（CNC）加工的透明亚克力材料制成，气道和培养基腔室由多孔聚碳酸酯膜（孔径0.4 µm）分隔，两端以3D打印的锥形接口连接外部气流系统。计算流体动力学（CFD）模拟在Ansys Fluent软件中进行，采用层流模型和正弦波入口速度模拟振荡流，确定达到目标WSS所需的气流速度。原代人鼻腔上皮细胞（human nasal epithelial cells, HNECs）来自商业来源和鼻拭子分离，扩增至第3代后以500,000 cells/cm²的密度接种在胶原蛋白I包被的膜上。细胞在培养24–48小时达到完全汇合后建立ALI，培养基改为Pneumacult-ALI培养基，只保留在基底侧。实验分为三组：对照组（无气流）、单次气流组（仅在第21天施加0.5 dyne cm⁻²的生理WSS 30分钟）和预处理组（第14–20天每天施加0.05 dyne cm⁻² WSS 30分钟，第21天施加0.5 dyne cm⁻² WSS 30分钟）。气流装置由质量流量控制器（mass flow controller）、在线加湿器和真空泵组成，置于培养箱中，控制器以12 cycles/min的呼吸频率产生双向正弦流。细胞活力和分化通过Image-iT Dead Green染色和免疫细胞化学（immunocytochemistry）进行评估，标志物包括紧密连接蛋白ZO-1、纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白（acetylated-α-tubulin）和杯状细胞标志物MUC5AC。跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）使用基于Arduino的自制系统测量，以评估屏障完整性。核形态和取向通过DAPI染色后使用自定义MATLAB代码计算核偏心率（eccentricity）和取向角度。MUC5AC分泌量通过ELISA检测，炎症细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α通过Luminex多重检测和ELISA分析。所有统计分析在GraphPad Prism中完成，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验，显著性设为p ≤ 0.05。

研究结果显示，鼻腔气道芯片能够在21天的ALI培养期内维持高分化的鼻上皮细胞。活死染色显示三组细胞均未出现明显的死细胞信号，平均细胞密度在各组间无显著差异，说明芯片在气流条件下仍能维持培养。ZO-1、乙酰化α-微管蛋白和MUC5AC在各组均表达，表明细胞形成了紧密连接和纤毛及杯状细胞分化。纤毛和杯状细胞的比例在各组间无统计学显著差异，但单次气流组的纤毛形态比对照组和预处理组更不规则，“手指状”结构不明显。TEER值在第6天达到峰值，三组之间各时间点均无显著差异，且每组在气流前后TEER值也无显著变化，说明屏障完整性在气流处理后仍然保持。核形态分析显示，单次气流组的平均核偏心率（0.6587±0.0139）显著高于对照组（0.5575±0.0133，p=0.0018）和预处理组（0.6069±0.0094，p=0.0388），表明急性气流使细胞核发生伸长。核取向分布直方图显示单次气流组的核大多垂直于气流方向排列，其分布与对照组和预处理组差异显著（p=0.0017和p=0.0010）。预处理组的偏心率虽有增加（相对于对照p=0.0472），但低于单次气流组，且取向分布与对照组无显著差异，说明预处理减弱了急性剪切应力引起的形态反应。黏液分泌结果显示，单次气流组在气流后MUC5AC分泌量显著高于预处理组（p=0.0319），与对照组的差异接近显著（p=0.0534），而预处理组与对照组无显著差异，表明预处理降低了气流诱导的急性黏液高分泌。炎症细胞因子分析中，IL-8在对照组和单次气流组之间存在显著差异（单次气流组分泌更多，p<0.05），预处理组则趋于降低IL-6、IL-8和TNF-α的分泌，但未达到95%置信水平的显著性。这些结果共同说明单次生理气流暴露会对已分化的鼻上皮细胞造成急性应力，而预处理则可以减少这种应力反应。

研究的结论是，气流预处理可能使鼻上皮细胞在体外获得更生理化的表型，减少急性气流暴露引起的形态改变、黏液过度分泌和炎症趋势。该研究的科学价值在于首次提出了针对鼻上皮细胞的气流预处理方案，并用实验证据证明预处理有助于形成更稳健的细胞表型，为今后建立更准确的鼻黏膜体外模型提供了重要依据。其应用价值在于这种鼻腔气道芯片可用于研究呼吸力学对上皮功能的影响，也可用于药物筛选、气道疾病建模和吸入毒理学研究。论文的亮点包括：利用无量纲数优化芯片几何结构以模拟生理气流和呼吸频率；在细胞分化过程中施加亚生理水平WSS进行预处理；结合CFD模拟和实验验证了壁面剪切应力的可控性；以及从形态、屏障功能、黏液分泌和炎症反应多维度评估预处理效果。此外，研究还讨论了湿度和温度可能影响预处理效果，并指出未来应探索不同预处理时长和强度对基因表达的影响，以及改进芯片以支持活纤毛成像和黏液纤毛清除的定量分析。