清华大学医学院干细胞与再生医学中心的Fengzhi Zhang、Yonglin Zhu、Jie Na等学者于2021年2月在《Biomaterials》期刊（Volume 271, 120713）发表了一项关于人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）高效分化为血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）和平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）的创新研究。这项研究开发了一种不含胰岛素（insulin-free）的简化化学成分确定培养基系统（AATS培养基），显著提高了血管细胞分化的效率和可扩展性，为再生医学中的血管修复治疗提供了新的解决方案。

学术背景

在再生医学领域，利用hPSCs分化的血管细胞治疗缺血性疾病（如心肌梗死、中风等）具有重要前景。然而，现有分化方法存在三个关键瓶颈：一是培养基成分复杂（如B27含27种成分），存在批次差异；二是动物源成分可能引入异种抗原；三是高成本阻碍规模化生产。更关键的是，既往研究未充分关注胰岛素对血管分化的调控作用——虽然胰岛素抑制心肌分化已被证实，但其对血管谱系的影响尚不明确。基于PI3K/AKT/mTOR通路在维持干细胞多能性中的作用，研究团队假设去除胰岛素可通过代谢重编程和激活自噬（autophagy）促进血管中胚层分化。

研究流程与方法

1. 胰岛素去除促进血管中胚层诱导

研究首先利用MESP1-mTomato报告基因hESC系（H9-mT）验证胰岛素的作用。在基础培养基（RPMI 1640）中添加四种成分：重组人白蛋白（recombinant human albumin）、L-抗坏血酸-2-磷酸镁（L-ascorbic acid 2-phosphate）、人脱铁转铁蛋白（human apo-transferrin）和亚硒酸钠（sodium selenite），构成AATS培养基。通过流式细胞术发现，不含胰岛素条件下，即使低浓度BMP4（5 ng/mL）也能诱导90%以上MESP1+中胚层细胞，而含胰岛素组（AATSi）效率显著降低（图1c）。转录组分析显示，AATS组中胚层转录因子（FOXC1、ISL1等）表达上调，而多能性基因（OCT4、LIN28A等）下调。ATAC-seq进一步揭示，AATS组开放染色质区域富含心血管中胚层转录因子结合基序（如GATA4/6、TEAD1）。

2. 代谢与自噬机制解析

通过LC-MS/MS代谢组学发现，AATS组细胞内糖酵解中间体（如磷酸烯醇式丙酮酸PEP）和三羧酸循环产物（如α-酮戊二酸α-KG）显著积累，而AATSi组更依赖糖酵解（图2b）。关键的是，AATS组环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，使用cAMP激动剂Forskolin可逆转胰岛素对中胚层分化的抑制（图2d-e）。透射电镜观察到AATS组早期出现自噬溶酶体（autolysosomes），Western blot显示LC3-II蛋白水平在分化9小时内即显著增加（图2f-i），表明胰岛素去除通过抑制mTOR激活自噬通路。

3. 高效血管细胞分化体系建立

在AATS培养基中，研究团队建立了两步分化方案（图3a）：
- 阶段I（0-3天）：用BMP4和CHIR99021诱导中胚层，hPSCs分化为FLK1+祖细胞效率达38%（vs. AATSi组27.7%）。
- 阶段II（3-8天）：EC分化添加VEGF和bFGF，获得CD31+CD144+双阳性细胞（53.7%）；SMC分化使用PDGF-BB和TGFβ1，SM22α+细胞比例超过90%（图4e）。值得注意的是，仅在阶段I去除胰岛素即可实现高效分化，说明胰岛素主要影响早期命运决定。

4. 功能验证与规模化生产

分化的ECs表现出典型功能：摄取乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）和体外成管（图3h-i）；SMCs对卡巴胆碱（carbachol）刺激表现收缩反应（图4g-h）。通过3D微支架（microscaffold, MS）培养，从100万hPSCs可扩增出4亿CD31+细胞（400倍）（图6h）。动物实验中，将ECs与SMCs混合移植到小鼠下肢缺血（CLI）模型，14天后形成人源CD31+血管（图7d-e），显著改善血流灌注；在脑卒中（MCAO）模型中，移植ECs促进神经元存活（图7i），运动功能恢复。

主要结果与结论

1. 机制发现：胰岛素去除通过cAMP升高和自噬激活，促使hPSCs从糖酵解转向氧化磷酸化，加速多能性退出和中胚层分化。
   
2. 技术突破：AATS培养基仅含4种成分，成本降低且无动物源成分，CD31+EC纯度可通过简单传代提升至98%（图6e-f）。
   
3. 治疗价值：分化的ECs具有动脉特征（高表达EFNB2、DLL4），且免疫原性基因（HLA-A/B/C）表达低于原代HUVECs，适合异体移植。

研究亮点与价值

1. 理论创新：首次阐明胰岛素通过代谢-自噬轴调控血管分化的机制，补充了干细胞命运决定的代谢调控理论。
   
2. 技术优势：AATS系统兼容2D/3D培养，结合微支架实现规模化生产，符合GMP标准。
   
3. 转化意义：在CLI和MCAO模型中证实功能血管再生能力，为缺血性疾病提供了”即用型”细胞治疗方案。

该研究的局限性在于未阐明cAMP下游的具体效应分子，且3D培养的长期稳定性需进一步验证。未来可探索AATS培养基在其他谱系分化（如造血干细胞）中的应用，并开发冻存方案以促进临床转化。