丁香酚通过Nrf2/GPX4通路抑制髓核细胞铁死亡减轻椎间盘退变的研究报告

作者及发表信息

本研究由Shuai Sun、Xun Lu、Shu Yang等共同完成（共享第一作者），通讯作者为Chongan Huang和Xiangyang Wang。研究团队来自温州医科大学附属第二医院骨科、温州医科大学第二医学院、浙江省-香港联合脊柱疾病精准诊疗实验室等多个机构。该研究发表于Free Radical Biology and Medicine期刊2026年第242卷（508-520页），于2025年11月5日在线发表。

学术背景

研究领域：本研究属于骨科/脊柱退行性疾病领域，聚焦椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）的分子机制及治疗策略。

研究背景： - 临床需求：下腰痛（Low Back Pain, LBP）是全球最常见的肌肉骨骼疾病，而IVDD是其首要病因。目前针对IVDD的药物疗法主要局限于症状缓解，缺乏有效阻止疾病进展的靶向治疗。 - 科学基础：近年研究发现，铁死亡（Ferroptosis，一种铁依赖的程序性细胞死亡形式）在IVDD进展中起关键作用，其特征是脂质过氧化积累和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性降低。核因子E2相关因子2（Nrf2）作为抗氧化反应的主调控因子，可通过调控GPX4等靶基因抑制铁死亡。 - 药物选择依据：丁香酚（Eugenol）是一种天然苯丙素类化合物，具有抗氧化、抗炎特性，且在形态学和无血管特性上与髓核细胞（Nucleus Pulposus, NP）相似的软骨细胞中显示出保护作用。

研究目标： 1. 验证丁香酚是否通过Nrf2/GPX4通路抑制NP细胞铁死亡 2. 阐明丁香酚对细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解的影响 3. 在动物模型中评估丁香酚对IVDD的治疗效果

详细研究流程

1. 网络药理学与分子对接分析

研究对象： - 丁香酚靶点：从SEA、Swiss等数据库筛选获得294个靶点 - IVDD相关靶点：通过OMIM和GeneCards收集2372个疾病靶点

方法流程： 1. 构建韦恩图识别81个共同靶点 2. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析确定核心靶点（Nrf2、GPX4、SLC7A11） 3. GO功能富集和KEGG通路分析显示主要涉及氧化应激反应和ROS代谢通路 4. 分子对接模拟（使用Autodock工具）验证丁香酚与Nrf2的结合特性

创新方法： - 采用多数据库联合策略提高靶点预测可靠性 - 发现丁香酚与Nrf2结合的关键残基（N414、R380等），结合自由能-5.9 kcal/mol

2. 体外细胞实验

研究对象： - 原代大鼠NP细胞（来自20只4周龄SD大鼠） - 人类NP细胞（不同IVDD严重程度患者来源）

实验设计： 1. 细胞毒性测试：CCK-8法评估丁香酚（6.25-100 μM）对NP细胞活力的影响 2. 铁死亡模型建立：使用RSL3（1 μM）诱导铁死亡 - 检测指标：细胞活力（CCK-8）、死亡细胞（Calcein-AM/PI染色） 3. 机制验证实验： - Western blot检测Nrf2、HO-1、GPX4、ACSL4蛋白表达 - 免疫荧光观察Nrf2核转位 - 铁离子（FerroOrange探针）、ROS（DCFH-DA探针）和脂质过氧化（BODIPY ⁵⁸¹⁄₅₉₁ C11探针）定量 4. 基因沉默实验：使用siRNA敲低Nrf2表达，验证通路必要性

关键发现： - 50 μM丁香酚显著逆转RSL3诱导的细胞死亡（p<0.01） - 上调GPX4（2.1倍）同时下调ACSL4（63%） - Nrf2沉默完全取消丁香酚的保护作用

3. 体内动物实验

研究对象： - 18只8周龄雄性SD大鼠，随机分为： - 假手术组（n=6） - IVDD模型组（n=6） - 低剂量治疗组（16 mg/kg/day，n=6） - 高剂量治疗组（33 mg/kg/day，n=6）

方法流程： 1. 模型建立：采用尾椎穿刺法（26G针头穿透纤维环） 2. 治疗干预：连续8周口服丁香酚悬浮液 3. 评估方法： - MRI T2加权像（Pfirrmann分级） - X线测量椎间盘高度指数（DHI） - 组织学分析（H&E、Safranin O、阿尔新蓝染色） - 免疫组化检测Nrf2、GPX4、MMP13、II型胶原表达

结果亮点： - 高剂量组DHI提高37%（p<0.01） - 组织学评分显示ECM降解显著改善 - Nrf2和GPX4表达上调，MMP13下调

主要研究结果

分子机制层面

1. 网络药理学：确定Nrf2为丁香酚关键靶点，其调控的抗氧化通路与铁死亡密切相关

2. 体外实验：

   • 丁香酚剂量依赖性地激活Nrf2（Western blot显示蛋白表达增加2.3倍）
   • 抑制铁死亡标志物：降低ROS水平42%、减少铁积累58%（p<0.001）
   • 改善ECM代谢：II型胶原增加1.8倍，MMP13降低55%

3. 机制验证：Nrf2 siRNA处理后，丁香酚对GPX4的上调作用消失（p<0.05），证实Nrf2通路的核心地位

动物模型层面

1. 影像学证据：

   • MRI显示高剂量组T2信号强度恢复至假手术组的82%
   • Pfirrmann分级从IV级改善至II-III级

2. 组织学证据：

   • 治疗组蛋白聚糖含量增加2.1倍（阿尔新蓝染色）
   • 免疫组化显示GPX4阳性细胞比例从18%提升至65%

研究结论

科学价值： 1. 首次阐明丁香酚通过Nrf2/GPX4轴抑制NP细胞铁死亡的分子机制 2. 为IVDD提供了新的治疗靶点（铁死亡调控通路） 3. 证实天然化合物在脊柱退行性疾病治疗中的潜力

应用价值： 1. 丁香酚作为已获FDA公认安全（GRAS）的物质，具有快速临床转化的优势 2. 提出的联合治疗策略（抗氧化+铁死亡抑制）为IVDD综合治疗提供新思路

研究亮点

1. 创新发现：

   • 首次将铁死亡机制与丁香酚的IVDD治疗作用相联系
   • 揭示Nrf2核转位是丁香酚发挥保护作用的关键步骤

2. 方法学创新：

   • 整合网络药理学、分子对接与实验验证的多学科方法
   • 建立RSL3诱导的NP细胞铁死亡标准化模型（1 μM，24h）

3. 转化意义：

   • 明确丁香酚的有效剂量范围（25-50 μM体外，16-33 mg/kg体内）
   • 为开发局部给药系统（如纳米颗粒载药）提供理论基础

其他有价值内容

局限性讨论： 1. 未评估丁香酚可能的过敏反应 2. 未探讨铁死亡与其他细胞死亡方式（如凋亡、焦亡）的交互作用 3. 动物模型未能完全模拟人类IVDD的慢性进展特征

未来方向： 1. 开发基于丁香酚的缓释给药系统 2. 探索与其他靶向治疗（如干细胞疗法）的联合策略 3. 开展临床前安全性评估