本研究由Paula Perez-Corredor, Timothy E. Vanderleest, Guido N. Vacano, Justin S. Sanchez, Nelson D. Villalba-Moreno, Claudia Marino, Susanne Krasemann, Miguel A. Mendivil-Perez, David Aguillón, Marlene Jiménez-del-Río, Ana Baena, Diego Sepulveda-Falla, Francisco Lopera, Yakeel T. Quiroz, Joseph F. Arboleda-Velasquez* 和 Randall C. Mazzarino* 等学者共同完成。参与机构包括美国哈佛医学院眼科系Schepens眼科研究所、Massachusetts General Hospital、德国汉堡大学医学中心神经病理学研究所、哥伦比亚安蒂奥基亚大学神经科学组等。该项研究以《APOE3 Christchurch modulates β-catenin/Wnt signaling in iPSC-derived cerebral organoids from Alzheimer’s cases》为题，于2024年3月20日发表在学术期刊《Frontiers in Molecular Neuroscience》上。
学术背景 本研究的科学领域集中于神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease, AD）的分子发病机制及遗传保护机制。阿尔茨海默病是最常见的痴呆症病因，其特征是大脑中淀粉样蛋白（Amyloid-β）斑块和tau蛋白缠结的形成，导致神经元死亡和认知功能衰退。其中，常染色体显性遗传性阿尔茨海默病（Autosomal Dominant Alzheimer‘s Disease, ADAD）约占患者的1%，而大约70%的ADAD患者携带早老素-1（Presenilin-1, PSEN1）基因突变。研究团队先前在哥伦比亚一个携带PSEN1 E280A突变的大型家族（Paisa家系）中发现了一位特殊的女性患者（研究中称为患者α）。尽管她携带致病的PSEN1 E280A突变且大脑内有极高的淀粉样蛋白负荷，但其认知能力衰退和tau病理（tauopathy）的出现时间被显著延迟（直到70多岁才出现轻度认知障碍），表现出对ADAD的极端抵抗性。遗传分析发现，她是载脂蛋白E3 Christchurch变异体（Apolipoprotein E3 Christchurch, APOE3ch，即R136S突变）的纯合子，该变异被认为是导致其抵抗性的候选因素。然而，由于仅发现此一例纯合子抵抗病例，无法通过传统遗传学手段直接确认其因果性。因此，本研究旨在利用患者来源的诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC）和大脑类器官（Cerebral Organoid）模型，探究APOE3ch变异背后的生物学通路和分子机制，以阐明其提供保护的原理，并为开发AD治疗新策略奠定基础。
详细工作流程 本研究设计了一个综合性、多步骤的实验流程，核心是利用基因编辑技术操控iPSC模型，并结合多组学分析来揭示APOE3ch的作用机制。
首先，是研究对象的选取与模型构建。研究选取了两位来自Paisa家系的女性患者：受保护的病例（患者α，APOE3ch纯合子，PSEN1 E280A突变）和未受保护的对照病例（患者ω，APOE3野生型，PSEN1 E280A突变，在预期年龄发病）。通过静脉穿刺获取了她们的外周血单核细胞，并使用Cytotune 2.0将其重编程为iPSC。随后，研究团队运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对这两株iPSC进行了一系列精准的基因修饰，以构建等基因对照（isogenic control）和功能获得/缺失模型。具体操作包括：在患者α的细胞中敲除APOE3ch变异（恢复为野生型APOE3），以及在患者ω的细胞中敲入APOE3ch变异。同时，还在两株细胞中尝试了纠正PSEN1 E280A突变（恢复为野生型PSEN1）。通过Sanger测序筛选和核型分析验证，最终成功获得了8株用于研究的细胞系（来自每位患者的4株，涵盖了不同的APOE和PSEN1基因型组合，见表1）。所有细胞系均通过了多能性标志物检测和三胚层分化能力验证。
其次，是大脑类器官的分化与早期表型验证。研究使用商业化的Stemdiff脑类器官试剂盒，将上述8株iPSC系分化为大脑类器官，并在分化第29天进行分析。为了验证该模型能否反映AD相关病理，研究首先通过免疫荧光分析了早期病理性tau磷酸化的标志物——在Ser396位点磷酸化的tau蛋白（phospho-tau S396, ptau S396）。结果显示，在携带PSEN1 E280A突变的患者ω对照类器官中，ptau S396水平较高；而在其PSEN1被纠正为野生型的类器官中，该磷酸化水平降低。关键在于，当通过基因编辑将APOE3ch变异引入患者ω的细胞后，其类器官中的ptau S396水平显著降低至与PSEN1野生型相似的水平。相反，在患者α的类器官中，敲除其天然的APOE3ch变异会导致ptau S396水平显著升高。这些结果表明，APOE3ch变异能够在iPSC衍生的脑类器官模型中产生一种保护性的早期tau磷酸化模式，且这种效应独立于PSEN1的基因型。
第三，是单细胞RNA测序（scRNA-seq）与通路分析。为了在全基因组范围内探索APOE3ch影响的生物学过程，研究对来自所有8个细胞系的类器官进行了scRNA-seq。数据分析流程如下：使用10x Genomics平台进行测序，利用Seurat R软件包进行数据质量控制、归一化和聚类分析。通过基因集富集分析（GSEA）和专门的细胞类型注释工具（scSA）对细胞簇进行鉴定，识别出神经元、神经前体细胞、放射状胶质细胞、祖细胞、少突胶质细胞和神经内皮细胞等类型。将所有样本的数据整合后，研究将数据集转换为“伪批量”（pseudo-bulk）数据，以识别广泛的转录组差异。通过Panther通路过度表达分析，他们发现APOE3ch变异显著影响了两个相关的信号通路：Wnt信号通路和钙粘蛋白（Cadherin）信号通路，二者都涉及β-连环蛋白（β-catenin）。进一步的分析显示，这种通路调节在神经元簇和胶质细胞簇中均有体现。深入检查差异表达基因发现，APOE3ch显著下调了多个Wnt配体（如WNT2B， WNT4， WNT7B）的转录水平，但并未影响β-连环蛋白本身的转录。
第四，是蛋白质水平验证与形态学分析。基于scRNA-seq的发现，研究转向蛋白质水平进行验证。他们重点分析了脑类器官中一种常见的结构——神经玫瑰花结（neural rosette），它模拟了具有顶-基底极性的神经管样结构。免疫荧光染色显示，与对照相比，携带APOE3ch变异的类器官中，β-连环蛋白的蛋白水平显著升高，尤其是在玫瑰花结的顶端区域（ribbon-like）和假复层上皮中呈现更均匀的分布。通过MATLAB进行图像分割和定量分析，证实了APOE3ch类器官玫瑰花结的“体部”和“带状区”β-连环蛋白荧光强度均显著增加。此外，APOE3ch类器官还表现出更成熟的神经元标志物Reelin的高表达，并且玫瑰花结的面积更大，提示其可能具有更成熟的表型。
第五，是患者脑组织的验证。为确认类器官研究结果在真实人脑组织中的相关性，研究对先前已去世的患者α（APOE3ch纯合子，PSEN1 E280A突变）的尸检脑组织进行了分析。选取了具有不同程度保护特征的三个脑区：额叶皮层（最受保护）、海马体和枕叶皮层。通过免疫荧光共定位分析β-连环蛋白、神经元核抗原（NeuN，神经元标志物）和细胞核（DAPI），他们发现额叶皮层中β-连环蛋白在细胞核内共定位的比例显著高于海马和枕叶皮层，这表明在该受保护最显著的脑区，β-连环蛋白通路活性更高。
第六，是分子机制的功能性验证。上述发现揭示了一个看似矛盾的现象：APOE3ch导致多个Wnt配体转录下调，却伴随着β-连环蛋白蛋白水平的升高。研究团队推测，这可能是因为存在一种Wnt通路的激活剂，引发了内源性Wnt配体的代偿性下调。他们直接将APOE3蛋白本身作为怀疑对象。利用一个稳定含有TCF/LEF报告元件（调控萤火虫荧光素酶表达）的HEK293细胞系（Wnt报告细胞系），他们进行了体外报告基因实验。结果发现，单独使用重组APOE3野生型或APOE3ch蛋白均不能激活Wnt信号。然而，当与经典Wnt配体Wnt3a共同处理时，APOE3ch表现出增强Wnt3a信号的作用，而APOE3野生型则起到抑制Wnt3a信号的作用（这与之前APOE4抑制Wnt信号的报道部分一致）。进一步的剂量反应实验证实了APOE3ch对Wnt3a信号增强的剂量依赖性。这一发现表明，APOE3ch获得了一种新的、意想不到的功能——作为Wnt3a信号的增强剂，这是一种新形态（neomorphic）的功能获得性特性。
主要结果 1. 模型验证结果：成功构建了来自ADAD保护病例和对照病例的iPSC系，并通过CRISPR/Cas9编辑获得了精准的基因型组合。脑类器官模型证实，APOE3ch变异能独立于PSEN1背景，显著降低早期病理性tau磷酸化（ptau S396）水平，重现了患者的保护性表型。 2. 组学发现结果：scRNA-seq分析揭示，APOE3ch变异显著调节了Wnt和钙粘蛋白信号通路。具体表现为多个Wnt配体（WNT2B， WNT4， WNT7B）转录水平下调，提示该变异深刻影响了这些通路的转录景观。 3. 蛋白质与形态结果：免疫荧光定量分析证实，在APOE3ch脑类器官中，β-连环蛋白的蛋白水平显著升高，且分布模式改变。同时，APOE3ch类器官表达更多成熟神经元标志物Reelin，神经玫瑰花结面积更大，表明其发育或成熟状态可能不同。 4. 患者组织验证结果：在受保护的APOE3ch患者尸检脑组织中，保护最显著的额叶皮层显示出更高水平的核内β-连环蛋白共定位，为类器官研究发现提供了直接的人体组织证据支持，并将APOE3ch的保护效应与Wnt/β-连环蛋白通路活性在空间上关联起来。 5. 机制阐明结果：体外报告基因实验提供了关键的机制性见解，证明APOE3ch蛋白本身具有作为Wnt3a信号增强剂的新功能（而APOE3野生型为抑制剂）。这解释了为何在Wnt配体转录下调的情况下，β-连环蛋白通路活性反而增强，即APOE3ch可能通过直接增强Wnt配体（如Wnt3a）的信号传导，导致负反馈调节使内源性配体表达下降，但最终净效应是通路激活和β-连环蛋白稳定。 这些结果层层递进：从建立模型验证APOE3ch的表型效应，到通过无偏见的组学分析发现其影响的核心通路（Wnt/β-连环蛋白），随后在蛋白质和形态学层面验证这一发现，接着在患者真实脑组织中确认其相关性，最后通过功能实验直接揭示了APOE3ch获得性新功能的分子机制。每一步的结果都为下一步的研究提供了逻辑依据和验证目标，共同指向了APOE3ch通过增强Wnt/β-连环蛋白信号来发挥神经保护作用的结论。
结论与意义 本研究得出结论：APOE3 Christchurch变异通过一种新形态的分子机制发挥对阿尔茨海默病的保护作用。该机制的核心是APOE3ch蛋白获得了增强Wnt3a信号传导的能力，从而稳定并提升了β-连环蛋白的水平。β-连环蛋白的积累会抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）的活性，而GSK3β正是磷酸化tau蛋白（如S396位点）并推动其病理变化的关键激酶。因此，APOE3ch通过激活Wnt/β-连环蛋白通路，间接抑制了GSK3β，减少了早期病理性tau磷酸化，这可能是其抵抗认知衰退和tau病理的关键环节。 本研究的科学价值在于：1) 首次在等基因控制的iPSC-脑类器官模型中直接证明了APOE3ch变异对tau磷酸化的保护性调节作用；2) 通过整合scRNA-seq、蛋白质组学、形态计量学和功能性报告实验，系统性地揭示了APOE3ch影响的核心信号通路是Wnt/β-连环蛋白通路；3) 最重要的是，发现了APOE3ch作为一种Wnt信号增强剂的新功能，这为理解APOE蛋白功能的多样性及其在AD中的作用机制开辟了全新视角。其应用价值在于：该研究揭示的Wnt/β-连环蛋白通路作为APOE3ch保护作用的下游效应器，为开发基于“受保护病例灵感”的阿尔茨海默病及tau蛋白病治疗策略提供了全新的潜在靶点。针对该通路的药物干预，可能模拟APOE3ch的保护效应，为广大的AD患者带来希望。
研究亮点 1. 重要的发现：发现了APOE3 Christchurch变异作为Wnt3a信号增强剂的全新功能，并阐明其通过激活Wnt/β-连环蛋白通路、可能通过抑制GSK3β来减少tau磷酸化，从而发挥保护作用的分子机制。 2. 新颖的方法与工作流程：研究采用了高度精细的CRISPR/Cas9基因编辑策略，在同一患者背景（Paisa家系PSEN1 E280A突变）下，构建了包含APOE3ch功能获得和功能缺失的等基因iPSC模型组，极大减少了遗传背景噪音。同时，结合iPSC-derived脑类器官这一能模拟早期发育和疾病相关表型的体外模型，与scRNA-seq等高通量技术、定量图像分析以及患者尸检组织验证相结合，构成了一个从模型建立、机制筛选到功能验证和临床关联的完整、严谨的研究闭环。 3. 研究对象的特殊性：研究的出发点是极为罕见的、对常染色体显性遗传AD具有极端抵抗性的单个病例。通过对这一“自然界实验”的深入分子解析，成功地将临床观察转化为可验证的生物学机制，体现了转化医学的研究思路。
其他有价值的内容 研究团队在讨论部分还提出了几个有价值的观点和未来方向：第一，APOE3ch的保护作用可能是多机制的，例如其与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）结合能力的改变也可能参与其中。第二，PSEN1 E280A突变本身在脑类器官中导致了异常的tau磷酸化和发育差异，这表明年轻的脑类器官可以作为研究AD病理和保护机制的实用模型。第三，研究也承认了当前模型的局限性，例如需要更成熟的类器官来确认保护表型的持久性，以及需要进一步研究APOE3ch对Wnt信号其他调节因子（如分泌蛋白组）的影响。第四，作者指出了潜在的利益冲突，部分研究者与开发APOE3ch灵感疗法的公司存在关联，并已申请相关专利，这提示该发现具有明确的商业化治疗开发前景。