学术研究报告：基于CRISPR/Cas13 sgRNA介导的RNA-RNA互作检测新方法SARID在活细胞中的应用

一、作者与发表信息
本研究的通讯作者为Zhen-Dong Xiao和Qi Zhang，团队来自中山大学附属第三医院生物治疗中心（Biotherapy Center, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University）及Reforgene Medicine等机构。研究成果发表于期刊《Advanced Science》（2024年10月），文章标题为“CRISPR/Cas13 sgRNA-Mediated RNA–RNA Interaction Mapping in Live Cells with APOBEC RNA Editing”。

二、研究背景与目标
长链非编码RNA（lncRNA）在基因表达调控中发挥重要作用，但其作用机制研究多集中于与蛋白质或DNA的互作，而lncRNA与其他RNA分子的互作网络仍存在巨大空白。现有技术如RNA下拉实验（RNA pulldown）、染色质RNA免疫共沉淀（ChRIP）等存在效率低、需免疫沉淀或交叉联定等问题，难以在活细胞中原位捕捉动态RNA-RNA互作。

本研究旨在开发一种无需免疫沉淀、高灵敏度的原位RNA-RNA互作检测方法——SARID（sgRNA scaffold assisted RNA-RNA interaction detection）。该方法整合了CRISPR/Cas13系统靶向RNA、sgRNA工程化改造及邻近RNA编辑技术，首次实现了活细胞内lncRNA互作转录本的精准标记与高通量鉴定。

三、研究流程与方法
1. 筛选最优dCas13效应蛋白
- 评估了5种催化失活的Cas13变体（如dcas13a、dcas13b等），通过RNA免疫共沉淀（RIP）验证其对lncRNA NEAT1的结合效率。结果显示，截短版的dcas13b（dpspcas13b短版本）结合亲和力最高（图1d-e）。

1. sgRNA工程化改造

   • 将sgRNA的tetraloop区域替换为MS2适配体（MS2 aptamer），以招募额外效应蛋白（如MCP-APOBEC1融合蛋白）。改造后的sgRNA不影响Cas13的催化活性（图2d）。
     

2. 标记位点优化

   • 对比了三种标记策略（dcas13的N端/C端融合Biotap标签、sgRNA-MS2招募MCP-Biotap），发现通过sgRNA-MS2标记的邻近蛋白（如NEAT1结合蛋白NONO/SFPQ）富集效率最高，表明sgRNA的tetraloop是最佳标记位点（图3a-c）。
     

3. SARID方法建立

   • 系统设计：将dpspcas13b（诱导型表达）、工程化sgRNA（靶向特定lncRNA）及MCP-APOBEC1（催化胞嘧啶至尿嘧啶编辑，C-to-U editing）共转染细胞（图4a-b）。APOBEC1在靶lncRNA邻近转录本上引入C-to-U标记，通过RNA-seq结合SAILOR分析流程识别互作RNA（图4c）。
     

4. 应用与验证

   • NEAT1互作组鉴定：发现1,665个新转录本互作，富集于细胞周期、自噬等通路（图5e）。通过TRSA-RIP实验验证了19/21随机候选互作RNA的真实性（图5g）。
     
   • 其他lncRNA（XIST、MALAT1等）扩展应用：分别鉴定471和430个互作基因，其中仅少数（65/471）曾被全基因组互作方法捕获（图6a），证明SARID的高灵敏度。
     
   • 可重复性验证：针对低丰度lncRNA（如NBR2、DANCR），不同sgRNA或重复实验的编辑位点一致性高（EPKM相关系数R²>0.86，图7e-h）。
     

四、主要结果与逻辑关联
1. dCas13b的高效靶向性为SARID提供了稳定的RNA定位基础（图1）。
2. sgRNA-MS2工程化突破了传统dCas13末端融合的局限性，实现了效应蛋白的灵活招募（图2-3）。
3. APOBEC1邻近编辑通过C-to-U标记避免了免疫沉淀的偏差，首次实现活细胞原位互作图谱（图4-5）。
4. 跨lncRNA验证（NEAT1、XIST、MALAT1等）表明SARID的普适性，且灵敏度优于现有技术（图6-7）。

五、结论与价值
1. 科学价值：揭示lncRNA可能通过直接结合mRNA（而非仅作为miRNA海绵或蛋白支架）调控基因表达，提出了“lncRNA-mRNA互作调控”的新范式。
2. 技术价值：SARID为RNA互作研究提供了免免疫沉淀、高灵敏度的通用工具，可扩展至circRNA、snoRNA等其他RNA分子。
3. 应用潜力：适用于癌症、代谢疾病等涉及lncRNA异常的研究，为靶向RNA互作的药物开发奠定基础。

六、研究亮点
1. 方法创新：首次将CRISPR/Cas13、sgRNA工程化与邻近编辑技术整合，突破活细胞RNA互作检测的技术瓶颈。
2. 发现新颖性：揭示lncRNA与大量mRNA的直接互作，挑战了其传统功能认知。
3. 技术普适性：验证了从高丰度（NEAT1）到低丰度（DANCR）lncRNA的广泛应用潜力。

七、其他价值
SARID兼容多种邻近标记酶（如APEX2、ADAR），未来可通过替换效应蛋白进一步拓展应用场景（如RNA-蛋白互作研究）。此外，其模块化设计为其他CRISPR衍生工具的开发提供了参考框架。