本研究由江南大学工业生物技术教育部重点实验室、生物技术学院的王强、胡梦凯、许美娟、饶志明和张贤教授团队，与伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校生物工程系的鲍腾共同完成，并以“efficient acetoin production in bacillus subtilis by multivariate modular metabolic engineering with spatiotemporal modulation”为题，于2025年1月15日发表在期刊《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》（ACS Sustainable Chem. Eng. 2025, 13, 1927−1936）上。
本研究的学术背景聚焦于生物制造领域，特别是利用微生物细胞工厂生产高附加值平台化学品。乙偶姻是一种广泛应用于食品、医药、化妆品、化学合成和农业的挥发性化合物，具有作为生物基平台化学品的巨大潜力。传统的工业乙偶姻生产主要依赖于基于化石原料的化学合成法，存在环境损害问题。相比之下，微生物发酵法生产的乙偶姻在安全性上更具优势，更易被食品和医药等行业接受。然而，目前使用常用底盘细胞枯草芽孢杆菌进行乙偶姻发酵面临生产效率低、周期长、成本高等挑战。为了应对这些挑战，本研究旨在通过多变量模块化代谢工程策略，并结合时空调控手段，系统性地改造枯草芽孢杆菌，重新分配其碳代谢流，增强关键酶的协同催化能力，并动态调节细胞内辅助因子水平，最终实现乙偶姻的高效、高产合成，为工业化生产奠定基础。本研究的目标是构建一个高效的“细胞工厂”，提升枯草芽孢杆菌合成乙偶姻的能力。
详细研究流程如下： 本研究分为五个核心实验步骤，依次递进地对枯草芽孢杆菌底盘细胞进行工程化改造。
第一步，底盘细胞优化：删除非必需功能基因以重分配碳通量。研究以野生型枯草芽孢杆菌JNA 3-10为起点。首先，删除了编码胞外多糖（形成生物膜）的整个eps基因簇，获得重组菌株JNA01。其次，为了阻止细胞在发酵后期形成孢子（孢子形成会消耗大量能量和物质，并增加工程菌控制难度），又敲除了与孢子形成相关的spoiIE基因，得到重组菌株JNA02。通过摇瓶发酵实验，比较了起始菌株BM（JNA 3-10，已删除bdhA基因簇）、JNA01和JNA02在生物量、乙偶姻产量和葡萄糖消耗方面的表现，并通过透射电子显微镜观察和耐热性实验验证了孢子形成被阻断。
第二步，时空特异性增强关键酶表达：研究聚焦于乙偶姻合成路径中的两个关键酶——α-乙酰乳酸合成酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC），其中ALDC催化的脱羧反应是限速步骤。为了避免在发酵早期因蛋白过表达对细胞生长造成负担，研究者采用了时空调控策略。首先，使用阶段特异性启动子Psrfa来控制als和aldc基因的表达，使其在特定时期启动。其次，优化了als基因的起始密码子（从TTG改为ATG），提高了ALS的转录效率。第三，为了进一步增强ALDC的表达，在aldc基因的开放阅读框上游引入了不同的、可形成发夹结构的便携式5‘-UTR（非翻译区）序列（如UTR4, UTR7, UTR11, UTR12），以提高核糖体的识别和募集效率。通过构建包含不同UTR版本的重组菌株（JNA03至JNA07），在摇瓶中进行发酵，检测了细胞生物量、ALDC比酶活、乙偶姻效价及副产物含量。
第三步，利用DNA支架系统实现酶的空间协同组装：为了促进ALS和ALDC的快速、有序催化，防止不稳定的中间产物α-乙酰乳酸扩散或降解，研究采用了蛋白质支架策略。将ALS和ALDC分别与不同的锌指蛋白结构域（ADB1和ADB2）融合，构建了融合蛋白。同时，构建了含有相应锌指蛋白结合位点（B1和B2）的DNA支架质粒，并通过改变质粒上B1和B2位点的比例（1:1， 1:2， 2:1）来调节两种酶在空间上的锚定比例。将优化了UTR（UTR12）的菌株与不同比例的DNA支架系统结合，构建了重组菌株JNA08、JNA09和JNA10，在摇瓶发酵中评估了其乙偶姻合成效率、生产速率和单位细胞产量。
第四步，构建逻辑门电路动态调控辅助因子水平：在发酵中后期，糖酵解产生大量NADH，导致细胞内NAD+/NADH比例失衡，这不仅会阻碍氧化反应，还会促进依赖NADH的副产物（如2,3-丁二醇、乳酸、乙醇）的生成。为了解决此问题，研究构建了一个基于丝氨酸整合酶Bxb1的“一输入-两状态”逻辑门电路。该电路设计为在特定时间点（发酵约48小时）通过添加木糖诱导Bxb1表达，进而催化DNA重组，启动NADH氧化酶（yodc[N20D, N116E]突变体）的表达。NADH氧化酶能将NADH氧化为NAD+，从而提升细胞内NAD+水平，优化代谢通量分布。同时，为了解决Bxb1酶的泄漏表达问题，引入了ssrA/sspB蛋白降解系统，并利用mCherry指示蛋白验证了降解系统的有效性。将逻辑门电路系统整合到经过前述优化的菌株中，构建了最终的重组菌株JNA11。在摇瓶发酵中，于48小时诱导NADH氧化酶表达（此时菌株标记为JNA11n），检测了诱导前后细胞内NAD+和NADH水平的变化、乙偶姻和主要副产物的产量。
第五步，放大验证：5升发酵罐补料分批发酵。为了评估最终优化菌株JNA11n的工业化生产潜力，研究在5升生物反应器中进行了补料分批发酵实验，并与起始菌株BM进行对比。发酵过程中监测了细胞生物量、溶氧、pH等参数，并在葡萄糖耗尽后进行流加以维持底物浓度。在发酵约48小时时，对JNA11n进行诱导，启动NAD+再生系统。全程检测乙偶姻、生物量及各类副产物的动态变化，最终计算乙偶姻的最高效价、生产速率和得率。
主要研究结果如下： 在底盘细胞优化步骤中，删除eps基因簇的菌株JNA01细胞生物量显著提高，OD600稳定期维持在21左右，且在消耗相同量底物时表现出更高的乙偶姻产量。进一步删除spoiIE基因的菌株JNA02，其OD600最大值达到23.0，乙偶姻最高效价为34.8 g/L，乙偶姻摩尔转化率比起始菌株BM提高了6%。透射电镜证实JNA02仅形成前孢子样隔室而非完整孢子，耐热性实验显示其几乎全部死亡，表明孢子形成被成功阻断。这些结果证明，删除非必需基因不仅改善了细胞生长和产物合成能力，还提高了底盘细胞对工业应用的适应性。
在增强关键酶表达步骤中，优化起始密码子后，ALS最大比酶活从183.6 U/mg提高至258.9 U/mg。引入不同5’-UTR后，ALDC的酶活得到显著增强，其中使用UTR12的重组菌株JNA07的ALDC最大比酶活达到68.2 U/mg，是JNA02的5.09倍。相应地，JNA07的乙偶姻最高效价达到40.2 g/L，是JNA02的1.2倍，生产速率提高了1.4倍。同时，副产物如乳酸的产量从3.7 g/L降至2.1 g/L。结果表明，通过启动子和UTR元件的精细调控，可以在不造成过大生理负担的前提下，有效增强限速酶表达，驱动代谢流转向目标产物。
在DNA支架系统步骤中，与未使用支架的JNA07相比，引入DNA支架的菌株（JNA08, JNA09, JNA10）在发酵36小时的乙偶姻效价分别提高了1.40、1.59和1.51倍。其中，B1与B2比例为1:2的菌株JNA09效果最佳。尽管这些菌株的生物量比JNA07下降了约15%，但单位细胞的乙偶姻产量（g/L/OD）显著提高，JNA09达到2.32 g/L，优于其他比例。这证实了通过DNA支架进行空间组织可以缩短酶促反应距离，保护中间产物，从而显著提高单位细胞的合成效率和产物合成速率。
在逻辑门电路调控步骤中，诱导表达NADH氧化酶后，重组菌株JNA11n的细胞内NAD+水平显著上升。其乙偶姻生产速率和葡萄糖消耗速率加快，乙偶姻最高效价达到44.3 g/L。同时，依赖NADH的副产物2,3-丁二醇、乳酸和乙醇的产量分别大幅下降了78.1%、63.2%和87.5%。然而，乙酸产量从0.6 g/L增加至1.7 g/L，推测是由于NADH氧化增强了呼吸链，促进了乙酸合成途径。该结果表明，在发酵中后期动态提升NAD+水平，能有效解决还原力过剩问题，抑制竞争性副产物的生成，同时加速底物消耗和产物合成。
在5升发酵罐验证中，最终重组菌株JNA11n表现出优异的性能。其生物量略低于起始菌株BM，但乙偶姻合成能力远胜后者。JNA11n实现了97.5 g/L的乙偶姻最高效价，生产速率达1.81 g/L/h，得率为0.46 g/g葡萄糖。与BM菌株相比，效价、生产速率和得率分别提高了1.97倍、2.24倍和1.21倍。副产物2,3-丁二醇的效价始终维持在很低的0.8 g/L左右，比BM降低了88.9%，其他副产物变化趋势与摇瓶结果一致。特别值得注意的是，该发酵过程未使用酵母浸粉或蛋白胨等昂贵氮源，凸显了其成本优势。
研究结论与价值： 本研究成功通过多变量模块化代谢工程结合时空调控策略，系统性地改造了枯草芽孢杆菌，显著提升了其乙偶姻的生产能力。研究证明，在优化底盘细胞的基础上，利用合适的生物调控元件调节代谢途径中限速酶的表达和组装，并通过在特定发酵时间调控辅助因子来重分配细胞内碳通量，可以大幅提高目标产物的效价和生产速率，同时避免因单纯提高酶表达水平而争夺额外资源和能量。
本研究的科学价值在于展示了一套完整的、从基因到发酵放大的代谢工程改造范例，融合了基因编辑、合成生物学（逻辑门电路、蛋白质支架）和发酵工程等多学科技术。它为解决微生物发酵中代谢流分布不均、辅助因子失衡、副产物竞争等普遍问题提供了创新的、可借鉴的策略（如时空特异性表达、酶的空间组装、动态辅助因子再生）。其应用价值尤为突出：所构建的工程菌株JNA11n在未使用昂贵氮源的条件下，达到了目前报道的枯草芽孢杆菌生产乙偶姻的最高效价（97.5 g/L）和较高的生产速率，且副产物显著减少，这为乙偶姻的工业化生物制造提供了极具竞争力的候选菌株和生产工艺，降低了生产成本和对环境的影响，符合绿色、可持续的化学工业发展方向。
研究亮点： 1. 创纪录的高产量： 在5升发酵罐中实现了97.5 g/L的乙偶姻效价，这是目前已报道的枯草芽孢杆菌生产乙偶姻的最高水平。 2. 创新的多策略集成： 并非采用单一的强化或敲除策略，而是创新性地将底盘细胞优化、时空特异性表达调控、酶的空间协同组装（DNA支架）以及基于逻辑门电路的动态代谢调控等多种先进策略模块化地集成到一个研究体系中。 3. 动态与时空调控的精准应用： 特别强调“时空调制”，使用阶段特异性启动子控制关键酶表达时机，并利用合成生物学逻辑门电路在发酵中后期动态开启NAD+再生系统，实现了对代谢过程的精细时空调控，优于传统的静态工程策略。 4. 显著的副产物抑制效果： 通过动态调节NAD+/NADH比例，将主要竞争性副产物2,3-丁二醇的产量降低了近90%，极大地提高了碳流向目标产物的特异性。 5. 工业化应用潜力巨大： 最终发酵工艺不使用昂贵组分，且使用的枯草芽孢杆菌是公认安全（GRAS）的微生物，菌株经改造后不产孢子，更有利于工业规模的控制和安全生产，从菌株安全性、工艺经济性和产物高效性多个维度展现了强大的工业化应用前景。
其他有价值内容： 本研究构建的所有菌株和质粒均列出了详细的表格（表1），包括其特点和来源，增强了研究的可重复性。文中提到的引物序列、Bxb1泄漏表达验证等详细信息可在其在线支持信息中获取。此外，研究对每一步策略的机理进行了合理推测和讨论，例如解释了删除eps基因簇可能使细胞表面更光滑利于物质摄取，DNA支架通过缩短反应距离和防止中间产物扩散来提高效率等，将实验现象与理论解释紧密结合，深化了对代谢工程改造效果的理解。