本文发表于 *Analytical Chemistry*，由加拿大魁北克毒理学中心（Centre de toxicologie du Québec, CTQ）、魁北克国家公共卫生研究所（Institut national de santé publique du Québec, INSPQ）的 Jean-François Bienvenu 等人完成，于2017年6月19日被接收。该研究属于分析化学与生物监测方法学领域，核心目标是建立一套标准化的实验流程，用于同时测定液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等分析方法中的基质效应（matrix effect, ME）、回收率（recovery, RE）、过程效率（process efficiency, PE）以及内标（internal standard, ISTD）匹配性。
一、研究背景与目的
在生物样本的定量分析中，基质效应是影响准确度、精密度和方法稳健性的重要因素。根据 IUPAC 定义，基质指样品中除待测物以外的所有组分。基质效应可能来源于共流出组分对电离效率的干扰、色谱分离效果、仪器残留或气相色谱中的基质诱导响应增强等。在 LC-MS 中，电喷雾电离（ESI）尤其容易受到基质效应的影响。对于生物监测项目而言，由于样本来源多样，基质效应差异较大，若不加以控制，可能导致待测物浓度被高估或低估，甚至无法检出。
此前已有一些评估基质效应的方法，如柱后灌注法（postcolumn infusion）和提取前/提取后加标法（pre- and postextraction spike methods）。Matuszewski 等人在2003年和2006年分别提出了绝对基质效应与相对基质效应的概念，但这些方法多需要使用空白基质，而在生物监测中，很多待测物在人群中普遍存在，难以获得完全不含待测物的空白基质。因此，本文作者旨在建立一种不依赖空白基质的标准化测试流程，并开发配套的 Excel 计算工具，以帮助方法开发和验证过程中快速、清晰地判断基质效应的来源和严重程度，从而降低时间和经济成本。
二、研究方法与工作流程
本研究建立了一套基于六组实验（set A 至 set F）和六份不同基质样本的标准化程序。六份基质样本应尽可能覆盖目标基质的多样性，例如尿液的比重范围可从约1.005到1.030。六组实验的设计如下：
这种方法允许使用本身就含有一定浓度待测物的真实基质样本，通过背景扣除来计算加标回收和基质效应。作者建议加标浓度至少应为原始浓度的4倍（即 q 值≥4），以保证结果的精密度。
在计算公式方面，作者提出了多个术语并加以区分。仪器基质效应（instrumental ME）用于描述分离技术和检测仪器对信号的影响，可通过 Set B 与 Set A 的峰面积比计算，若基质中含有本底待测物，则需从 Set B 中扣除 Set F。回收率（RE）定义为待测物经过前处理后被回收的比例，可通过 Set C 与 Set B 的峰面积比计算。过程效率（PE）为仪器基质效应与回收率的乘积，代表基质在整个分析过程中对待测物的综合影响，可通过 Set D 与 Set A 的峰面积比计算。全局基质效应（global ME）则是用浓度而非峰面积计算的过程效率，反映真实样品中定量结果的偏差，通过 Set D 与 Set E 的差值除以加标浓度计算。此外，还引入了校准曲线因子（curve factor），用于比较纯溶剂与校准曲线基质中响应比的差异。
作者还开发了 Microsoft Office Excel 工具，通过宏自动生成表格和图表，对结果进行条件格式着色。平均值为95%–105%且标准差低于5%的结果标记为绿色；偏差10%以内或标准差5%–10%标记为黄色；偏差15%以内或标准差10%–15%标记为橙色；偏差15%–20%标记为红色；超过±20%则需要重点关注。该工具还提供了描述符之间的逻辑关系图，帮助研究者从全局基质效应开始，逐步定位问题来源是仪器端还是样品前处理端。
作为应用实例，作者利用该流程开发并验证了一种用于尿液中多种邻苯二甲酸酯代谢物的 UPLC-MS/MS 定量方法。该方法涉及23种邻苯二甲酸酯代谢物，其中部分代谢物有对应的稳定同位素标记内标（SIL-ISTD），另有一些“孤儿”待测物（orphan STD）没有专属内标。样品前处理包括酶解去结合、液液萃取、蒸发复溶和 UPLC-MS/MS 分析。
三、主要结果与讨论
在邻苯二甲酸酯代谢物方法的验证中，大多数待测物的全局基质效应在可接受范围内。作者重点讨论了几个存在问题的待测物。
对于 MHBP，全局基质效应偏差为+15%，标准差仅2.9%。进一步分析发现，其内标归一化过程效率为102.6%，说明 MHBP 与其氘代内标 MHBP-d4 在真实样品和纯溶剂中行为相似，但校准曲线因子为112%，提示偏差来源于校准曲线所用的洗涤尿液基质与真实样品不同。此外，MHBP 的仪器基质效应为107.3%，标准差高达11.4%，主要由一个 q 值为0.5的样本引起；去除该样本后，标准差降至3.4%。MHBP 的回收率为76.1%，其内标回收率为84.0%，两者存在一定差异，导致内标归一化回收因子为93.5%。
对于 MNBP，全局基质效应的标准差高达11.6%，原因在于六个样本中有四个样本的原始浓度是加标浓度的3.6–8.2倍，q 值远低于推荐值。去除一个结果异常偏低的样本后，全局基质效应从93.6%变为98.0%，标准差从11.6%降至5.3%。MNBP 的仪器基质效应为85.7%，内标归一化仪器基质效应为84.3%，说明其13C内标未能完全补偿仪器端的基质效应。但其校准曲线因子为101.5%，表明校准曲线本身正确。
对于 MIBP，全局基质效应为106.0%，标准差15.9%，高标准差主要由一个原始浓度为加标浓度两倍的样本引起。去除该样本后，全局基质效应变为100.3%，标准差降至8.8%。MIBP 及其氘代内标 MIBP-d4 的仪器基质效应分别为87.2%和79.7%，但内标归一化仪器基质效应为101.5%，标准差却高达14.7%，说明个别样本中内标补偿效果不佳。回收率方面，MIBP 与内标行为一致，内标归一化回收因子为101.2%。
对于 MEP，两个样本的原始浓度高于加标浓度（q=0.6），导致全局基质效应为93.7%，标准差6.9%；去除这两个样本后改善为97.7%和3.8%。MEP 的仪器基质效应为75.8%，但其13C内标能较好地跟随待测物，内标归一化仪器基质效应接近100%。校准曲线因子为102.8%，说明洗涤尿液可以作为校准曲线基质。
在“孤儿”待测物的内标选择方面，作者利用该测试对所有内标与待测物的组合进行了比较。对于七种无专属内标的待测物，MEHHP-13C4、MECPP-13C4 和 MCMHP-d4 三种内标表现出可接受的全局基质效应和较低的标准差。综合考虑仪器基质效应和回收因子后，MEHHP-13C4 被选为最佳共用内标。为验证该选择，作者以 MIBP 为例，比较了 MIBP-d4 与 MBZP-13C4 作为内标的定量结果。结果表明，使用 MBZP-13C4 时，MIBP 的全局基质效应从106.0%±15.9%改善为97.2%±4.0%，仪器基质效应和回收因子的标准差也明显降低。在内部质控和德国外部质量评估计划（G-EQUAS）参考物质的比较中，两种内标定量结果的相关性良好（r²=0.9968），斜率接近1（0.9732），证明该内标替换是可行的。
四、结论与意义
本研究建立了一套标准化的六组六样本测试流程，能够在无需空白基质的情况下同时评估仪器基质效应、回收率、过程效率、全局基质效应以及内标匹配性。该流程通过引入背景扣除，允许使用含有本底待测物的真实基质样本，特别适用于生物监测中普遍存在的内源性或普遍暴露的待测物。作者强调，全局基质效应及其标准差是方法验证中最关键的指标；若出现问题，应从仪器端（仪器基质效应）和样品前处理端（内标归一化回收因子）两方面进行排查。
该研究还开发了配套的 Excel 工具，能够自动计算各描述符并进行可视化，显著提高了方法开发效率。在邻苯二甲酸酯代谢物方法的验证中，该流程成功识别了多个待测物存在的问题及其来源，并为“孤儿”待测物选择了合适的内标，验证了该方法的实用性。截至论文发表，该中心已使用此方法开发和验证了30余种分析方法。
五、研究亮点
本研究的亮点在于：第一，提出了一整套标准化的基质效应评估流程，统一了术语，区分了仪器基质效应与全局基质效应，明确了回收率与回收因子的差异；第二，通过背景扣除策略解决了难以获得空白基质的问题；第三，将六份样本的标准差纳入结果评价，体现了方法精密度；第四，开发了自动化 Excel 工具，降低了计算和分析的时间成本；第五，展示了如何利用该流程为无专属内标的待测物选择最佳内标，并通过外部质控数据验证了选择的有效性。这些工作为分析方法的开发与验证提供了清晰、可操作的框架，具有重要的科学价值和应用推广意义。