近日，一项发表于mBio期刊（2025年9月第16卷第9期）的重要研究揭示了宿主蛋白DAZAP2在抑制多种冠状病毒感染中的关键作用。该研究由来自复旦大学、中山大学、广州医科大学、广东省疾病预防控制中心、华南农业大学、海南大学等多个机构的科研人员合作完成，通讯作者为岳宏、张平、孙晶、赵金存和张荣。研究团队通过全基因组CRISPR敲除筛选，系统性地发现并证实了DAZAP2是一个泛冠状病毒限制因子，其通过抑制病毒的进入和基因组复制两个关键步骤来发挥强大的抗病毒功能，并在小鼠模型和人类原代气道上皮细胞中验证了其生理相关性。这项工作为理解宿主抵御冠状病毒感染的防御机制提供了新视角，并可能为开发基于宿主靶向的广谱抗病毒策略提供潜在靶点。
学术背景 冠状病毒科是一个包含多种可感染人类和动物的病毒家族，其中SARS-CoV-2引发了全球性的COVID-19大流行。尽管已有研究通过高通量筛选鉴定出一些促进病毒感染（前病毒）的宿主因子，但对限制病毒感染（抗病毒或限制性）的宿主因子的系统性探索仍显不足。全面了解病毒与宿主之间的相互作用，特别是宿主防御机制，对于理解病毒致病机理和开发新的治疗策略至关重要。先前有研究通过CRISPR筛选，在剔除的细胞中发现DAZAP2可能与SARS-CoV-2限制有关，但其具体作用机制（影响病毒生命周期的哪个环节）及其在体内的生理学意义仍不清楚。本研究旨在通过一种创新的筛选策略，系统性地寻找SARS-CoV-2的宿主限制因子，并聚焦于DAZAP2，深入解析其在冠状病毒感染周期中的作用机制及在体和离体的功能验证，以期为抗冠状病毒宿主防御提供新的理论依据。
详细工作流程 本研究包含五个主要环节：全基因组CRISPR筛选与验证、DAZAP2抗病毒活性的确认、对病毒进入环节的机制解析、对病毒基因组复制环节的机制探索，以及在体与离体生理相关性的验证。
1. 全基因组CRISPR筛选与候选基因验证 研究团队首先设计并实施了一项基于流式细胞分选的创新性全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。他们使用靶向19,114个人类基因的Brunello sgRNA文库，感染表达人ACE2受体的A549细胞（A549-ACE2）。与以往分析病毒筛选后“消失”细胞（dropout screen）以寻找抗病毒基因的思路不同，本研究采用“单周期复制”的SARS-CoV-2转录复制能力病毒样颗粒（Transcription- and Replication-competent Virus-Like Particle, TRVLP），该颗粒用绿色荧光蛋白（GFP）替代了病毒核衣壳（N）蛋白，因此只能完成一轮感染并在被感染细胞中表达GFP。研究人员在病毒感染24小时后，通过流式细胞术分选出高感染（GFP阳性）的细胞群体，提取其基因组DNA进行sgRNA测序分析。通过MAGeCK软件分析sgRNA的富集情况，从而推断哪些基因的敲除会增强病毒感染，即这些基因可能是天然的限制因子。
筛选结果将DAZAP2列为排名第二的候选基因（排名第一的是PDCD10）。为了验证筛选结果，研究团队选取了排名前20的基因，在A549-ACE2细胞中使用两个独立的sgRNA分别敲除这些基因，然后用携带纳米荧光素酶（NanoLuc）报告基因的TRVLP-NLuc进行感染测试。敲除DAZAP2可使病毒感染增强4倍以上，效果显著。为了确保结果的可靠性，他们进一步在表达ACE2的HeLa细胞（HeLa-ACE2）、生理相关的肺上皮细胞Calu-3以及表达人ACE2的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF-ACE2）中敲除DAZAP2，并用真实的SARS-CoV-2病毒进行感染实验。结果显示，在这些细胞系中敲除DAZAP2均能显著增强病毒感染（增强倍数从几倍到十倍不等），并通过蛋白质印迹（Western Blot）证实了敲除效率。随后，他们还将验证范围扩大到冠状病毒科的四个属（α, β, γ, δ），包括HCoV-229E、SADS-CoV、HCoV-OC43、小鼠肝炎病毒（MHV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）等，发现DAZAP2的敲除能普遍增强所有这些冠状病毒的感染。反之，过表达人或小鼠的DAZAP2蛋白则能抑制SARS-CoV-2的感染。通过构建DAZAP2敲除的克隆细胞系并进行回补实验，他们排除了脱靶效应，进一步证实了DAZAP2功能的特异性。
2. DAZAP2抑制SARS-CoV-2进入的机制解析 为了确定DAZAP2作用于病毒生命周期的哪个环节，研究团队首先利用伪病毒（Pseudovirus）系统进行了测试。他们发现，敲除DAZAP2能显著增强携带SARS-CoV-2或SARS-CoV-1刺突蛋白的伪病毒感染，而对携带水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）的伪病毒感染无影响，这表明DAZAP2特异性抑制冠状病毒的进入过程。
接下来，他们细致地将病毒进入过程分解为结合、内化、运输、与内体/溶酶体膜融合释放基因组四个步骤进行探究。实验证实，DAZAP2的缺失并不影响病毒与细胞表面的结合、内化进入细胞，也不影响病毒颗粒向晚期内体/溶酶体（标记物为LAMP1）的运输。同时，内体酸化水平以及刺突蛋白在内体中被组织蛋白酶（Cathepsin）切割成S2’亚基的过程也未受影响。
关键发现在于最后一步——膜融合。研究人员使用了一种改进的病毒-细胞膜融合报告系统：他们将亲环蛋白A（Cyclophilin A, CypA）与HiBiT片段融合，并包装到携带SARS-CoV-2刺突蛋白的伪病毒颗粒中。当病毒在细胞内与内体膜融合后，释放出的HiBiT片段会与细胞质中表达的LgBiT片段互补，形成有活性的NanoLuc荧光素酶。实验结果显示，在DAZAP2敲除的细胞中，荧光素酶活性显著高于对照细胞，表明病毒与内体膜的融合效率更高。使用真实病毒进行的共聚焦显微镜观察也提供了支持：感染4小时后，在对照细胞的晚期内体/溶酶体中能观察到更多共定位的病毒颗粒（N蛋白与LAMP1共定位），而在DAZAP2敲除的细胞中，这些内体内的病毒颗粒减少，但指示病毒复制的中间体——双链RNA（dsRNA）信号却更强。这表明在敲除细胞中，更多病毒成功地完成了膜融合并释放了基因组进入细胞质，从而启动了复制。
除了内体途径，SARS-CoV-2还可通过细胞膜途径（依赖于TMPRSS2蛋白酶）进入。为了研究DAZAP2是否也抑制这一途径，研究团队在A549-ACE2细胞中额外表达了TMPRSS2。他们发现，在抑制了内体途径后，敲除DAZAP2依然能通过TMPRSS2依赖的膜途径增强病毒感染。通过细胞-细胞融合实验（即表达刺突蛋白的细胞与靶细胞共培养形成合胞体）和基于分裂荧光素酶的细胞融合定量实验，他们直接证实了DAZAP2的缺失能增强刺突蛋白介导的细胞膜融合。DAZAP2能同时抑制SARS-CoV-2通过内体途径和细胞膜途径进入细胞。
3. DAZAP2抑制SARS-CoV-2基因组复制的机制探索 由于筛选所用的TRVLP系统模拟了病毒的进入和早期复制，研究者推测DAZAP2可能也影响复制过程。为了验证这一点，他们构建了一个SARS-CoV-2复制子系统，将病毒基因组中从刺突蛋白到ORF8的区域替换为NanoLuc报告基因。将体外转录的复制子RNA电转入细胞后，可以独立于病毒进入过程，专门监测病毒基因组的复制和翻译。实验发现，敲除DAZAP2能显著增强复制子报告基因的表达；相反，过表达DAZAP2则抑制其表达。使用RNA聚合酶抑制剂瑞德西韦（Remdesivir）处理可消除这种增强效应，证实观察到的信号确实来自病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）介导的复制。定量PCR检测病毒基因组RNA水平也支持这一结论。
那么，DAZAP2是影响了病毒复制酶蛋白的最初翻译（由进入的基因组直接翻译），还是影响了后续的基因组复制过程？为了区分这两个步骤，研究团队构建了一个“复制缺陷型”复制子：他们在Nsp1和Nsp2之间插入了报告基因，同时突变了RdRP催化位点（D760N/D761N），使其失去复制功能。这样，电转入细胞后产生的荧光信号仅代表由进入的病毒基因组进行的初次翻译。实验结果显示，在对照和DAZAP2敲除的细胞中，初次翻译的水平没有差异。这表明DAZAP2并不影响病毒复制酶蛋白的最初合成，而是特异性地抑制了后续的病毒基因组RNA复制。
4. 作用机制的初步探索与生理相关性验证 DAZAP2如何发挥上述作用？研究人员首先排除了它是干扰素刺激基因（ISG）的可能性，因为干扰素处理不能诱导其表达。在缺失关键先天免疫信号分子（STAT1, MAVS, IRF3）的细胞中，DAZAP2的抗病毒功能依然存在，说明其作用不依赖于经典的干扰素通路。亚细胞定位分析发现，内源性的DAZAP2蛋白主要定位于细胞核，在病毒感染后也未发生明显改变，且不与早期内体或晚期内体/溶酶体共定位。这暗示DAZAP2的抗病毒作用可能是间接的，可能通过调控某些宿主基因的表达来实现。尽管此前有研究将DAZAP2的功能与调控SERPINE1基因联系起来，但本研究中敲除SERPINE1并不影响病毒感染。同时，DAZAP2的敲除也不影响已知的SARS-CoV-2进入因子（如ACE2, TMPRSS2, Cathepsin L等）的表达水平。因此，DAZAP2具体调控哪些下游基因来发挥抗病毒功能，仍有待未来研究阐明。
最重要的验证在于生理层面。研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了全身性敲除DAZAP2的小鼠（DAZAP2−/−）。这些小鼠生长发育正常。用小鼠适应的SARS-CoV-2 Beta变异株感染后，敲除小鼠肺部的病毒载量显著高于野生型小鼠。使用非适应性的原始毒株感染表达人ACE2的转基因小鼠（hACE2）及其与DAZAP2敲除小鼠杂交的后代（hACE2-DAZAP2−/−），也得到了相同的结果：DAZAP2缺失导致肺部病毒载量和炎症因子（如IL-6, TNF-α）水平升高。值得注意的是，在鼻腔灌洗液中未观察到显著差异，这可能与病毒在这些模型上呼吸道复制效率较低有关。
为了在人类系统中验证，研究人员使用了气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养的人原代鼻上皮细胞（hNEC）和支气管上皮细胞（hBEC），这是模拟人体呼吸道生理状态的理想模型。他们先对上皮干细胞进行CRISPR编辑敲除DAZAP2，然后将其分化成完整的上皮组织进行病毒感染。结果显示，在支气管上皮细胞中，敲除DAZAP2能显著增加细胞内的病毒RNA水平和上清液中的病毒滴度；在鼻上皮细胞中也观察到了增强趋势。这有力地证明了DAZAP2在人体生理环境下同样是一个重要的冠状病毒限制因子。
主要结果 * 筛选与验证结果：全基因组CRISPR筛选成功鉴定出多个潜在的SARS-CoV-2限制因子，其中DAZAP2排名靠前，验证实验证实其敲除可显著增强病毒感染。 * 泛抗病毒活性结果：DAZAP2对冠状病毒科四个属的代表毒株均具有限制作用，其功能和序列在小鼠与人类间具有保守性。 * 抑制病毒进入的机制结果：DAZAP2不干扰病毒结合、内化和运输，但能有效抑制病毒颗粒与内体膜及细胞膜的融合，从而阻止病毒基因组释放到细胞质。相关证据包括：融合报告系统活性增强、内体内病毒颗粒减少、胞内病毒复制中间体增加、细胞-细胞融合增强等。 * 抑制基因组复制的机制结果：DAZAP2特异性抑制病毒基因组RNA的复制，但不影响病毒复制酶蛋白的初次翻译。证据来自复制子实验、定量PCR以及复制缺陷型复制子实验的对比。 * 生理相关性验证结果：在DAZAP2敲除小鼠模型中，SARS-CoV-2在肺部的复制显著增强，并伴随更严重的炎症反应。在人原代气道上皮细胞ALI培养模型中，敲除DAZAP2同样增强了病毒感染。 * 作用模式推断结果：DAZAP2主要定位于细胞核，其抗病毒功能不依赖于干扰素通路，且不通过调控已知的进入因子或SERPINE1实现，提示其可能通过转录调控等间接方式发挥作用。
结论与意义 本研究系统性地将DAZAP2确立为一个关键的泛冠状病毒宿主限制因子。其科学价值在于首次全面阐明了DAZAP2抗冠状病毒的双重机制：既在病毒进入阶段充当“融合阻断剂”，又在进入后阶段充当“复制抑制剂”。这一发现极大地丰富了我们对宿主细胞内抗病毒防御网络的认识，揭示了一种不依赖经典干扰素通路的新型防御策略。从应用价值来看，DAZAP2作为一个保守的宿主蛋白，其本身或其调控的通路可能成为开发广谱抗冠状病毒药物的潜在靶点。通过增强DAZAP2的功能或模拟其作用机制，有望为应对当前及未来可能出现的冠状病毒威胁提供新的宿主导向治疗思路。
研究亮点 1. 创新性的筛选策略：采用基于FACS分选感染细胞的全基因组CRISPR敲除筛选，直接富集易感细胞，为系统性发现宿主限制因子提供了有效方法。 2. 机制的深度与系统性：不仅确认了DAZAP2的抗病毒活性，还精确定位其作用于病毒进入的膜融合步骤和基因组合成步骤，并利用先进的融合报告系统、复制子系统等进行了多角度验证，逻辑严密。 3. 严格的生理相关性验证：研究不仅停留在细胞系水平，还充分利用了基因敲除小鼠模型和高度生理相关的人原代气道上皮3D培养模型，有力证明了DAZAP2在机体防御中的实际功能。 4. 广谱性的重要发现：证实DAZAP2对多种冠状病毒具有普遍限制作用，这使其研究价值超越了单一的SARS-CoV-2，对于应对冠状病毒家族的多样性具有重要意义。
其他有价值内容 研究中还鉴定出其他有潜力的限制因子，如已知的干扰素相关基因PLSCR1（在本筛选中显示最强的抗病毒效果），以及PDCD10、CAB39、VTA1等，为后续研究提供了丰富的线索。此外，研究中对病毒进入和复制各个环节的实验设计精巧，例如使用TRVLP系统实现安全、便捷的单周期感染检测，以及构建复制缺陷型复制子来区分翻译和复制，这些方法学上的细节对于相关领域的研究者具有很高的参考价值。