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作者及机构
本研究由Ziyuan Dai、Hao Wang、Zhanghao Feng、Li Ma、Shixing Yang、Quan Shen、Xiaochun Wang、Tianji Zhou和Wen Zhang共同完成。Ziyuan Dai和Hao Wang为并列第一作者，Wen Zhang为通讯作者。研究团队分别来自江苏大学医学院检验医学系和徐州医科大学附属淮安医院临床检验科。研究于2021年9月8日在线发表在期刊《Infection, Genetics and Evolution》上，文章编号为105077。
学术背景
本研究属于病毒学领域，特别是环状病毒科（Circoviridae）的研究。环状病毒是一类最小的自主复制病毒，分为环状病毒属（Circovirus）和环病毒属（Cyclovirus）。尽管环状病毒已在多种脊椎动物中被发现，但其在濒危保护动物中的感染情况尚未得到详细研究。大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是中国特有的濒危物种，其健康受到多种威胁，包括病毒感染。本研究旨在通过病毒宏基因组学和PCR方法，从大熊猫血液样本中检测并鉴定新型环状病毒，以增加对环状病毒多样性和进化关系的理解。
研究流程
研究共分为四个主要步骤：样本采集与处理、病毒宏基因组学分析、病毒检测与全基因组获取、分类学与系统发育分析。
样本采集与处理
2019年6月，研究团队从中国陕西省秦岭大熊猫研究中心的12只健康大熊猫中采集了血液样本。这些大熊猫年龄在2至11岁之间，包括5只雌性和7只雄性。每只大熊猫采集2毫升血液，使用真空管保存并通过冷链运输。样本在实验室中用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，涡旋混匀后离心，收集上清液并保存在-80°C备用。
病毒宏基因组学分析
将12个样本各取41.67微升混合成一个500微升的样本池，用于病毒宏基因组学分析。样本通过0.45微米滤器过滤，离心后收集富含病毒颗粒的滤液。滤液用DNase、RNase、Benzonase和Baseline-Zero处理，以消化未保护的核酸。随后使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取总核酸，并使用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit构建文库。测序在Illumina MiSeq平台上进行，生成250 bp的双端测序数据。数据分析使用自建的分析流程，包括去除克隆序列、修剪低质量序列、去除接头序列，并使用Ensemble Assembler进行从头组装。组装后的序列与定制的病毒蛋白数据库进行比对，以鉴定病毒序列。
病毒检测与全基因组获取
通过从头组装，筛选出两个与环状病毒Cap和Rep蛋白高度相似的基因组片段。基于这些片段设计特异性PCR引物，用于检测大熊猫血液样本中的环状病毒。PCR条件包括预变性、变性、退火和延伸步骤。若检测到阳性样本，则通过反向PCR扩增重叠片段以获取完整的环状病毒基因组。PCR产物纯化后克隆到pMD®18-T载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并进行测序。
分类学与系统发育分析
使用NCBI的ORF Finder和Geneious Prime®预测环状病毒的开放阅读框（ORF），并使用Mfold预测DNA二级结构。通过Clustal X分析氨基酸同源性，并使用MrBayes v3.2构建系统发育树。系统发育分析基于53个环状病毒和环病毒属成员的Rep蛋白氨基酸序列和全基因组核苷酸序列。距离矩阵分析用于评估新型环状病毒与其他环状病毒科成员的相似性。
主要结果
1. 新型环状病毒的发现
通过病毒宏基因组学分析，从大熊猫血液样本中鉴定出一种新型环状病毒，命名为大熊猫相关环状病毒（Giant Panda Associated Circovirus, GPCV）。三个样本的Cap和Rep基因检测为阳性，其余样本为阴性。三个阳性样本的核苷酸序列完全相同。
GPCV全基因组结构分析
GPCV基因组长度为2090 bp，GC含量为44.00%。基因组包含两个双向开放阅读框，分别编码Rep蛋白和Cap蛋白。Rep蛋白编码序列中预测有两个内含子。GPCV与Paguma larvata血清中的环状病毒PL-CV3的核苷酸序列相似性为79.91%。Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列分别与PL-CV9和PL-CV3具有80.35%和88.59%的相似性。GPCV基因组中预测有一个茎环结构，包含一个保守的非核苷酸序列和两个串联重复序列。
系统发育分析
系统发育分析显示，GPCV与PL-CV3形成一个姐妹群，表明它们具有共同的祖先。GPCV被鉴定为环状病毒属中的一个新物种，基于其基因组组织和序列相似性分析。
结论
本研究首次从大熊猫血液样本中鉴定出一种新型环状病毒GPCV，并对其全基因组进行了详细分析。GPCV的发现增加了对环状病毒多样性和进化关系的理解，为研究其基因表达调控和致病性提供了基础。研究还表明，环状病毒可能感染濒危动物，提示需要进一步研究其对这些动物的潜在影响。
研究亮点
1. 首次从大熊猫血液样本中鉴定出新型环状病毒GPCV。
2. 详细分析了GPCV的全基因组结构，包括其开放阅读框、内含子和茎环结构。
3. 通过系统发育分析，将GPCV鉴定为环状病毒属中的一个新物种。
4. 研究使用病毒宏基因组学和PCR方法，展示了其在病毒发现和基因组分析中的高效性。
其他有价值的内容
研究还讨论了环状病毒的致病机制，特别是其对免疫系统的影响。例如，猪环病毒2型（PCV2）和3型（PCV3）已知会引起免疫系统紊乱和多系统炎症。尽管GPCV的致病性尚不明确，但其在大熊猫血液中的发现提示需要进一步研究其潜在的健康影响。此外，研究还提出了未来研究方向，包括开发适合环状病毒培养的细胞系，以及研究GPCV的传播途径和感染机制。
以上报告详细介绍了研究的背景、流程、结果和意义，为其他研究者提供了全面的参考。