本研究由Daiyu Hu、Yuanqing Cao、Chenglin Cai、Guangming Wang、Min Zhou、Luying Peng、Yantao Fan、Qiong Lai和Zhengliang Gao共同完成，作者单位包括同济大学医学院上海阳光康复中心（上海养志康复医院）基础研究中心、上海大学医学院附属南通医院（南通市第六人民医院）老年医学研究所、上海大学医学院器官修复工程研究中心以及同济大学医学院上海东方医院心律失常教育部重点实验室。研究成果发表于2025年1月的《Neural Regeneration Research》期刊（Volume 20, Issue 1）。

学术背景

人类大脑发育是一个高度复杂的过程，传统动物模型因物种差异存在显著局限性。例如，小鼠大脑缺乏人类特有的外脑室下区（outer subventricular zone, oSVZ）和脑回结构，而非人灵长类模型则成本高昂且与人类存在生理差异。为解决这一问题，多能干细胞衍生的三维类脑器官（cerebral organoids）成为模拟早期人脑发育和疾病的新兴工具。本研究旨在建立一种改进的人类大脑类器官系统，用于模拟神经发育的时空特征，并评估环境毒素（如重金属镉）的神经毒性。

研究流程与方法

1. 类器官系统构建

研究采用H9人胚胎干细胞系（H9 ESC line, WA09），通过优化无导向培养方案构建大脑类器官：
- 胚胎体形成：用Accutase消化H9 ESC获得单细胞悬液，在超低吸附96孔板中聚集培养（9000细胞/孔），使用含低浓度bFGF（4 ng/mL）和Rho激酶抑制剂的培养基诱导神经分化。
- 神经上皮扩张：第6天将胚胎体转移至24孔板，改用含N2补充剂和肝素（10 μM）的神经上皮诱导培养基。第13天将类器官嵌入Matrigel以支持神经上皮扩增，第20天移除Matrigel以避免过度细胞迁移。
- 长期培养与分层：从第15天起使用含B27补充剂的分化培养基，持续培养至第70天，形成稳定的脑室区（ventricular zone, VZ）和皮质板（cortical plate, CP）结构。

2. 质量控制与表征

• 形态学评估：通过荧光显微镜监测类器官直径（第7天550–650 μm，第35天1.9–2.3 mm）及神经上皮芽（neuroepithelial buds）的形成。
  
• 免疫荧光标记：使用Sox2（神经干细胞）、Pax6（放射状胶质细胞）、Tbr1（前板神经元）、Ki67（增殖细胞）等抗体标记不同发育阶段的细胞类型，验证类器官的皮层分层和时空发育特征。
  

3. 镉神经毒性评估

• 暴露实验：从第35天起，用1、3、6 μM氯化镉（CdCl₂）处理类器官14天，每3天换液。
  
• 表型分析：通过亮场显微镜观察类器官边缘完整性，测量尺寸变化；免疫荧光检测凋亡（cleaved caspase-3）、DNA损伤（γH2AX）和增殖（pH3）标志物。
  

主要结果

1. 类器官发育模型

   • 成功构建的类器官重现了早期人脑发育的关键事件：神经上皮衍生、神经祖细胞增殖与维持、神经元分化和迁移、皮层分层（图1-3）。
     
   • 第35天后，VZ区出现Ki67+增殖细胞极化分布（主要位于脑室侧），与体内皮层发育一致（图2）。
     

2. 镉的神经毒性机制

   • 结构破坏：镉暴露导致类器官边缘塌陷、尺寸减小（6 μM组面积减少40%），皮层厚度显著降低（图5）。
     
   • 细胞凋亡与异常增殖：镉诱导VZ区大规模凋亡（cleaved caspase-3+细胞增加3倍），同时触发异位细胞增殖（pH3+细胞分散于皮质区），提示补偿性机制（图6）。
     
   • 祖细胞耗竭：镉通过促凋亡和早熟分化导致神经祖细胞池枯竭，破坏皮层分层（图5F）。
     

结论与价值

本研究建立了一种改进的人类大脑类器官系统，其优势在于：
1. 科学价值：首次在类器官模型中证实慢性低剂量镉暴露通过凋亡和补偿性增殖双重机制破坏神经发育，为环境毒素的神经毒性研究提供了新模型。
2. 技术创新：通过短期Matrigel嵌入（仅7天）优化培养方案，提高了类器官的均一性和可重复性。
3. 应用潜力：该平台可扩展至其他环境毒素（如微塑料、酒精）的神经发育毒性筛查，替代成本高昂的动物实验。

研究亮点

• 时空模拟准确性：类器官重现了人脑特有的oSVZ扩增和皮层分层，克服了小鼠模型的局限性。
  
• 毒性机制解析：揭示了镉通过凋亡-增殖失衡导致发育缺陷的动态过程，为干预策略提供靶点。
  
• 方法学优化：开发的培养流程简化了传统方案，更适合大规模毒性测试。
  

局限性与展望

当前模型缺乏血管和免疫细胞，未来可通过共培养体系进一步模拟体内微环境。此外，镉的跨胎盘转运机制需结合体内实验验证。