Bennett、Watson、Ragotte、Borst等来自华盛顿大学蛋白质设计研究所（Institute for Protein Design, University of Washington）及多家合作机构的研究人员，在《自然》（nature）杂志2026年1月1日第649卷上发表了题为“atomically accurate de novo design of antibodies with rfdiffusion”的研究。该研究首次展示了完全通过计算手段从头设计（de novo design）靶向用户指定表位的抗体，并通过冷冻电镜（cryo-EM）等实验手段在原子精度层面验证了设计的准确性。
抗体是现代医学中最重要的蛋白质治疗药物类别，目前全球已有超过160种抗体疗法获批，市场规模预计未来五年将达到4450亿美元。然而，抗体发现目前仍主要依赖动物免疫、随机文库筛选或从患者体内直接分离抗体，这些方法费时费力，且无法保证获得针对特定治疗相关表位的抗体。已有计算设计方法多集中于抗体优化阶段，而能够从头生成针对特定表位抗体的方法此前尚不存在。RFDiffusion已经在非抗体结合蛋白的从头设计方面取得进展，但其原始版本几乎完全依赖规则二级结构（螺旋或链）与靶点相互作用，无法直接设计抗体。
为解决这一问题，研究团队对RFDiffusion进行了微调，使其能够在给定目标结构、表位热点残基和抗体框架序列与结构的条件下，生成新的互补决定区（CDRs）以及抗体与靶点的整体对接方式。设计流程包括：RFDiffusion进行骨架设计，ProteinMPNN设计CDR序列，随后利用在抗体结构上微调过的RoseTTAFold2（RF2）预测设计结构，并以自洽性（预测结构与设计结构的高度相似性）和低预测对齐误差作为筛选标准。由于AlphaFold2在抗体—抗原复合物预测上表现不佳，团队专门微调了RoseTTAFold2以提高抗体结构预测和设计过滤能力。该微调网络在给定靶点结构和表位信息的条件下能够较好地区分真实复合物与诱饵复合物，并在单体抗体预测方面优于当时已有模型，尤其在CDR H3预测上表现更佳。
在实验验证阶段，团队首先设计并表征了仅含三个CDR的单域抗体（VHHs）。他们选择了人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA，并针对多个疾病相关靶点进行设计，包括艰难梭菌毒素B（TcdB）、流感H1血凝素（haemagglutinin）、呼吸道合胞病毒（RSV）位点I和III、SARS-CoV-2受体结合域（RBD）以及IL-7Rα。对RSV位点III、流感血凝素、RBD和TcdB的设计分别通过酵母表面展示筛选了9000个设计（RSV位点I和III、RBD、流感血凝素）或低通量大肠杆菌表达和表面等离子体共振（SPR）筛选了95个设计（TcdB、IL-7Rα和流感血凝素）。成功筛选出的VHH结合亲和力从低微摩尔到几十纳摩尔不等。例如，针对RSV位点III的最高亲和力VHH解离常数为1.4 μM，而针对流感血凝素的最高亲和力VHH亲和力达到78 nM，针对TcdB的VHH亲和力为262 nM。竞争实验证实了这些VHH结合在预期表位：RBD结合VHH与已解析结构的新设计结合蛋白AHB2竞争，TcdB结合VHH与FZD48竞争。TcdB VHH在CSPG4敲除细胞中中和毒素的半数有效浓度为460 nM，且不与高度同源的梭菌毒素TcsL（70%序列同源性）结合，显示了表位特异性。
在结构验证方面，冷冻电镜解析了设计VHH与天然糖基化流感血凝素三聚体的复合物结构，分辨率为3.0 Å。结果显示设计的VHH_flu_01以设计预测的角度结合在血凝素茎部表位，其骨架与设计模型的主链均方根偏差为1.45 Å，CDR3的偏差为0.8 Å，且CDR3关键残基的相互作用与设计一致。此外，针对TcdB的母体设计VHH_tcdb_h2复合物结构（4.6 Å）和经Orthorep亲和力成熟的VHH_tcdb_h2_ortho复合物结构（5.7 Å）均证实了设计的正确表位靶向和结合姿势。Orthorep是一种正交易错DNA复制系统，可使目标基因在体内持续超突变。通过Orthorep进行的亲和力成熟使VHH亲和力提升约两个数量级，同时保持了原始设计结合模式。
研究进一步将方法扩展至具有六个CDR的单链可变区片段（scFv）设计。由于scFv基因过长，无法通过常规寡核苷酸直接组装，团队开发了逐步组装策略，可特异配对重链和轻链，或将来自结构相似设计的重链和轻链进行组合文库构建。通过这种结构感知的组合文库筛选，他们获得了靶向TcdB Frizzled表位的scFv，亲和力从472 nM到72 nM不等。其中scFv5和scFv6转化为全长IgG1后，亲和力分别为380 nM和68 nM。scFv5与已知受体Frizzled-7竞争结合TcdB，但不与CSPG4竞争，证明表位特异性。冷冻电镜解析了scFv6与TcdB复合物的3.6 Å结构，显示全部六条CDR与设计模型的骨架偏差分别为：CDRH1 0.4 Å、CDRH2 0.3 Å、CDRH3 0.7 Å、CDRL1 0.2 Å、CDRL2 1.1 Å、CDRL3 0.2 Å，且CDR侧链旋转异构体构象也高度一致。scFv5的6.1 Å冷冻电镜结构也证实了设计的正确结合模式。这表明RFDiffusion能够以原子级精度设计双链抗体。
此外，团队还针对PHOX2B肽—HLA-C*07:02复合物（一种神经母细胞瘤相关肽—MHC复合物）设计了scFv。采用二硫键稳定化的pMHC靶点，并利用组合装配策略，获得了亲和力约400 nM（SPR）或1 μM（等温滴定量热法）的结合物。该结合物对R6A点突变肽无结合，显示了对目标肽残基的特异性。尽管其亲和力尚未达到CAR-T细胞杀伤实验所需水平，但证明了结构基础设计可靶向具有临床重要性的肽—MHC表位。
研究还分析了AlphaFold3作为设计过滤器的潜力。在结构验证的VHH库中，AlphaFold3的界面预测模板建模分数（ipTM）与结合成功率相关（曲线下面积为0.86），仅9%的设计ipTM大于0.6。对于scFv库，6个实验验证的设计中有5个ipTM超过0.85，而初始库中仅4%达到该阈值。这表明引入AlphaFold3 ipTM过滤将显著提高设计成功率。
该研究的核心结论是：通过微调的RFDiffusion结合实验筛选，可以在原子级精度上从头设计靶向特定表位的VHH、scFv和全长抗体。冷冻电镜结构证实了设计的准确性，包括高度可变的H3环和整体结合取向。这是首次结构验证的从头设计抗体案例。该方法的关键优势不在于生成针对靶点的抗体本身（纯实验方法也可实现），而在于能够精确靶向特定表位，这对于阻断受体—配体相互作用的拮抗剂、避免与内源性分子竞争的抗体、诱导构象变化的调节剂以及靶向保守病毒表位的抗体均至关重要。
研究亮点包括：首次实现完全计算驱动的表位特异性抗体从头设计；开发了微调的RFDiffusion和RoseTTAFold2用于抗体设计；结合Orthorep实现亲和力成熟同时保持设计结合模式；开发了结构感知的重链轻链组合文库策略以克服六CDR设计难度；并通过多个冷冻电镜结构在原子水平上验证了设计精度。此外，研究还开放了代码和训练数据集，为后续研究提供了基础。然而，文章也指出当前设计成功率仍然较低，未来需要进一步改进生成模型和过滤方法，并设计更接近人源CDR的序列以降低免疫原性。