本研究由德国格赖夫斯瓦尔德大学医学中心人类遗传学系的Robin A. Pilz、Dariush Skowronek等学者合作完成，发表于2023年2月的《International Journal of Molecular Sciences》期刊（卷24期4，文章编号3993）。研究聚焦于脑海绵状血管畸形（Cerebral Cavernous Malformation, CCM）的分子机制，特别是CCM1基因缺失对多能干细胞（iPSCs）内皮分化过程中基因表达特征的影响。

学术背景

CCM是一种以脑脊髓毛细血管-静脉病变为特征的神经血管疾病，家族性病例由CCM1（KRIT1）、CCM2或CCM3基因杂合突变引起。尽管”二次打击”机制（two-hit mechanism）在CCM发生中的作用已被确认，但基因失活后是否需要额外外部因素触发病变尚不明确。既往研究表明，内皮细胞中CCM蛋白缺失会导致KLF2/4信号通路上调，但CCM1在非内皮细胞（如多能干细胞或中胚层祖细胞）中的功能仍知之甚少。本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术构建CCM1敲除的iPSCs模型，系统分析其在多能干细胞、早期中胚层祖细胞（EMPCs）及内皮样细胞（ECs）分化过程中的转录组变化，以揭示CCM1缺失的细胞类型特异性效应。

研究流程与方法

1. 模型构建与验证

研究者采用CRISPR/Cas9技术对AICS-0023 iPSCs（Allen Cell Collection来源）的CCM1基因第10外显子进行编辑，通过单细胞克隆筛选获得CCM1−/− iPSCs系。基因组测序验证了基因敲除效率，Western blot确认CCM1蛋白表达缺失。对照组为同源野生型（CCM1+/+）iPSCs。

2. 多阶段分化与样本采集

使用StemDiff内皮分化试剂盒进行定向分化：
- iPSCs阶段：评估多能性标志物（SSEA4/OCT4/SOX2/TRA-1-60）表达。
- EMPCs阶段（分化第3天）：检测中胚层标志物α-SMA和Brachyury。
- ECs阶段（分化第7天扩增后）：通过CD31/vWF/VE-cadherin免疫荧光确认内皮特性。每个阶段设置3个生物学重复。

3. 转录组分析

• RNA测序：Illumina NovaSeq平台进行150 bp双端测序，数据比对至GRCh37人类参考基因组。
  
• 差异表达分析：DESeq2软件（|log2FC|>1且padj<0.05为阈值），GO和KEGG通路富集分析通过ShinyGO 0.76完成。
  
• 验证实验：qPCR检测KLF2/4、THBS1等关键基因，抗体芯片分析血管生成相关蛋白（如VEGF/PDGF），多重液相芯片定量炎症因子。
  

4. 创新方法

• 时序分化转录组对比：首次在CCM1−/− iPSCs分化全程（iPSCs→EMPCs→ECs）进行RNA-seq动态监测。
  
• 微环境模拟：通过添加促血管生成细胞因子（如VEGF/bFGF），模拟体内内皮细胞微环境对CCM1缺失的响应。
  

主要结果

1. 内皮特异性基因表达特征

   • CCM1−/− ECs中鉴定到342个差异基因（181上调/161下调）。显著上调基因包括KLF2（log2FC=4.3）、KLF4（3.5）、LHX6（5.4）；下调基因如TCN1（-3.6）、MMP9（-3.3）。
     
   • 通路分析显示：血管形态发生（GO:0048514，FDR=1.2E-8）、细胞迁移（GO:0030334，FDR=3.5E-6）和Notch信号（KEGG:04330）显著富集。
     

2. 阶段依赖性效应

   • iPSCs阶段：仅CCM1表达下调（log2FC=-2.0），LHX5微弱上调（1.9，padj=0.045）。
     
   • EMPCs阶段：26个基因上调（如STMN2，2.1）、2个下调（CCM1，-1.8），KLF2已出现低水平升高（1.4）。
     
   • 主成分分析（PCA）显示ECs阶段组间差异最大，而iPSCs/EMPCs几乎重叠。
     

3. 功能验证

   • 蛋白水平：血管生成抗体芯片未发现显著差异，可能与体内复杂微环境缺失有关。
     
   • KLF2/4靶基因验证：THBS1（血栓反应蛋白1）下调1.1倍（p<0.01），ADAMTS4（基质金属蛋白酶）上调2.2倍（p<0.001），与既往动物模型一致。
     

结论与意义

本研究首次证明：
1. 细胞谱系特异性：CCM1缺失的分子表型仅在内皮分化后显现，提示存在”静默”的前体细胞群体，需特定微环境（如促血管因子）触发病变。
2. 治疗靶点启示：针对MEKK3-KLF2/4通路或微环境调控（如VEGF抑制）可能比直接纠正CCM1突变更具可行性。
3. 疾病模型优化：iPSCs分化体系为CCM机制研究提供了可标准化的人类细胞模型。

研究亮点

• 动态转录组解析：揭示CCM1缺失效应从iPSCs到ECs的渐进性演变。
  
• 微环境关键作用：提出”第三打击”假说（非遗传因素）在CCM发生中的必要性。
  
• 技术整合：结合CRISPR编辑、时序分化与多组学分析，为神经血管疾病研究提供范式。
  

补充价值

研究者将RNA-seq数据公开于GEO（GSE214306），抗体芯片与液相芯片的阴性结果提示未来需构建共培养或类器官模型以更好模拟体内病变微环境。该工作得到德国研究基金会（DFG RA ²⁸⁷⁶⁄₂-2）等基金支持。