在药物化学和药物发现领域，手性3-羟基氧化吲哚是一类重要的基础功能分子，因其多样的药理活性而备受关注。其中，3-羟基-3-羟甲基氧化吲哚（3HhMOs）作为一类具有相邻双羟基官能团的特殊结构，不仅是强效蛋白酶体抑制剂TMC-95A-D等天然产物的核心骨架，其未受保护的羟甲基也为构建多样化的衍生物提供了额外的化学修饰位点。然而，目前报道的化学合成方法仅能获得外消旋的3HhMOs产物，其立体选择性合成，特别是针对含有螺环季碳中心、空间位阻大的此类分子的对映选择性合成，仍然是一个巨大的挑战。近日，来自遵义医科大学药学院、贵州省药物分析重点实验室等机构的Run-Ping Miao, Hai-Xia Zhang, Kui-De Lu, Tong-Qiu Lu, Hui-Hui Wang, Yong-Zheng Chen和Nan-Wei Wan*研究团队在ACS Catalysis（2025, 15, 992-1001）上发表了一项重要研究成果，题为“结合卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶生物催化高效、对映互补合成3-羟基-3-羟甲基氧化吲哚”。该研究开创性地构建了一个新颖的双酶生物催化平台，首次实现了手性3HhMOs的对映互补性合成，为这类具有生物活性潜力的分子提供了高效、绿色且可规模化的合成路径。
该研究的学术背景植根于生物催化与不对称合成的前沿交叉领域。在有机合成中，生物催化因其高效、高选择性及环境友好的特点而成为有力工具。对于手性邻二醇的合成，已有多种生物催化方法，如环氧化物水解酶（Epoxide Hydrolases, EHs）催化的环氧化物对映选择性水解、脂肪酶或脱氢酶催化的外消旋二醇动力学拆分、以及羰基还原酶或醇脱氢酶催化的α-羟基酮不对称还原等。然而，对于像3HhMOs这样具有空间位阻大的螺环季碳中心的邻二醇，其立体选择性构建仍然极具挑战性。另一方面，卤代醇脱卤酶（Halohydrin Dehalogenases, HHDHs）是一类催化功能多样的酶，不仅能催化邻位卤代醇脱卤生成环氧化物，还能在叠氮化物、氰化物、氰酸盐、硫氰酸盐及亚硝酸盐等阴离子亲核试剂存在下，催化环氧化物的开环反应，生成相应的β-取代醇或其衍生物。研究团队此前发现，亚硝酸盐作为一种双位点亲核试剂，其进攻环氧化物的路径（氮进攻或氧进攻）可导致不同的产物：氮进攻产生β-硝基醇，而氧进攻则生成不稳定的亚硝酸酯中间体，随后自发水解即可得到邻二醇。本研究的核心目标正是开发一种生物催化策略，通过精确调控HHDH的催化选择性和对映选择性，利用其催化的亚硝酸盐氧进攻开环反应，从未实现立体选择性合成的螺环环氧氧化吲哚出发，高效制备光学纯的3HhMOs。
研究的具体工作流程可分为几个关键步骤，详细阐述了从催化剂开发到最终产物合成的完整路径。
第一步：HHDH催化的手性®-3HhMOs的对映选择性合成（动力学拆分）。 研究以模型底物螺环环氧氧化吲哚(rac)-1a与亚硝酸盐的开环反应为起点。团队首先筛选了来自Agrobacterium radiobacter AD1的HheC酶及其实验室此前构建的突变体库。这些突变体针对酶活性口袋中的五个残基位点（P84, F86, T134, N176, W249）进行了1-4个突变。初始筛选发现，野生型HheC（HheC-wt）能以中等对映选择性（E = 41）催化模型反应，得到29%产率、93% ee的®-1b。随后，团队对T134位点进行了饱和突变，成功获得了性能显著提升的突变体HheC-SM8（T134S）。该突变体表现出更高的催化效率和优异的对映选择性（E = 188），能以49%的产率和97%的ee值生成®-1b。值得注意的是，该反应具有极高的氧进攻选择性（O-selectivity），副产物1c（一种可能的硝基醇逆Henry反应产物）的产率极低（%）。团队对反应条件进行了优化，发现酸性环境（pH 6.5）有利于提高反应效率和亚硝酸酯中间体的自发水解，同时保持酶活性和对映选择性。为了克服底物溶解度限制，研究采用了一种底物分批补料的策略。使用0.2当量的亚硝酸钠，成功实现了高达250 mM（43.8 g/L）的(rac)-1a的转化。反应在7.5小时内完成，生成的®-1b和剩余(S)-1a的光学纯度分别达到94%和92% ee，证明了该方法良好的底物耐受性和规模化潜力。
第二步：EH催化的手性(S)-3HhMOs的对映特异性合成（水解）。 在第一步高效动力学拆分获得高光学纯度(S)-1a的基础上，研究团队致力于寻找一种方法将其转化为手性(S)-1b。他们首先尝试了酸促水解策略（盐酸或硫酸），但发现该过程几乎没有区域选择性，导致产物几乎外消旋化。因此，他们转向了酶催化水解策略。团队评估了包括HheC突变体在内的多种生物催化剂。其中，来自Parvibaculum lavamentivorans DS-1的环氧化物水解酶PleH2表现尤为突出，能以98%的产率和>99%的ee值将(S)-1a高效水解为(S)-1b。经过条件优化，在pH 7.5、使用10 g DCW/L重组大肠杆菌（PleH2）细胞的条件下，60 mM的(S)-1a在24小时内实现了95%的转化，且产物的光学纯度得以完全保持。这一发现为(S)-3HhMOs的合成提供了一个高效且高度区域选择性的生物催化剂。
第三步：双酶平台的对映互补性合成扩展与应用验证。 在获得高效催化剂HheC-SM8和PleH2后，研究团队系统评估了该双酶生物催化平台对多种螺环环氧氧化吲哚底物的普适性。所有®-3HhMOs的合成均在克级规模上进行。研究表明，该平台对底物7位（给电子或吸电子基团，如-F, -Cl, -Br, -CF3, -CH3）、6位、5位以及N原子上（甲基、乙基、丙基、异丙基、烯丙基）的不同取代基均表现出良好的耐受性。大多数反应均能以41-50%的产率（基于外消旋底物，经动力学拆分）和93%至>99%的ee值获得相应的®-产物，对映选择性（E值）高达110至200以上。然而，4位有取代基或N原子上有苯基、苄基等大位阻基团的底物，由于空间位阻阻碍了底物与酶活性中心的结合，无法被该生物催化体系接受。随后，所有从第一步动力学拆分中获得的剩余高光学纯度(S)-螺环环氧氧化吲哚( (S)-1-14a)均通过PleH2催化水解，以90-97%的产率和94-99%的ee值顺利转化为相应的(S)-3HhMOs ((S)-1-14b)。综合考虑第一步的分离损失，从外消旋原料出发，最终获得(S)-产物的总产率计算为39-47%。这一系列结果充分证明了该双酶平台在合成多种手性3HhMOs方面的有效性和对映互补性。
第四步：手性产物的绝对构型确定与衍生化应用。 研究通过X射线衍射分析确定了主要产物®-1b和(S)-1b的绝对立体构型，其他产物的构型则依此类推。为了进一步展示该平台产物的应用潜力，团队进行了几项代表性的转化反应。他们从光学纯的®-1b和(S)-1b出发，分别合成了手性螺环碳酸酯®-1d和(S)-1d（这类化合物被认为是潜在的神经系统药物活性剂），以及通过选择性酯化合成了新型手性3-羟基氧化吲哚衍生物®-1e和(S)-1e。所有转化反应均高效进行，并完全保持了起始原料的优异光学纯度，凸显了该生物催化平台在合成有价值的衍生化合物方面的可扩展性和实用性。
该研究的主要结果在每一步骤中都得到了详实的数据支持。HheC-SM8突变体的发现及其在动力学拆分中表现出的高E值（188）、高产率（49%）和高ee值（97%），构成了整个平台的第一块基石。底物分批补料实验的成功，直接证明了该方法处理高浓度底物的能力，为工艺放大提供了关键数据。PleH2酶的发现及其近乎定量的转化率和>99%的ee值，完美补全了平台的另一半，实现了剩余对映体的高效、高选择性利用。底物范围拓展实验产出的数十个高光学纯度®-和(S)-3HhMOs化合物及其详细的产率、ee值数据（见原文支持信息表S7，S8），系统性地证明了该平台的广泛适用性。这些结果逻辑连贯：高性能HHDH突变体实现了®-构型产物的高效获取和(S)-构型原料的高纯富集；高选择性EH则负责将富集的(S)-原料专一性地转化为(S)-构型产物，两者结合最终实现了从廉价易得的外消旋螺环环氧氧化吲哚出发，高效、对映互补地合成两个对映体纯的3HhMOs。衍生化实验的成功，则将平台的价值从基础合成延伸到了更具应用前景的分子构建上。
本研究的结论是，研究团队成功开发了一个创新的双酶生物催化平台，首次实现了手性3-## 评点，并总结其主要价值与亮点。首先，该研究构建了一个将HHDH催化的R-对映选择性开环反应与EH催化的S-对映特异性水解反应相结合的协同策略。利用工程化改造的HheC-SM8突变体，通过亚硝酸盐介导的、高度氧选择性的开环反应，实现了多种手性®-3HhMOs的高效合成。同时，新发现的PleH2酶能够以近乎完美的区域选择性和对映特异性，将剩余的(S)-螺环环氧氧化吲哚转化为(S)-3HhMOs。该平台采用易于获得的螺环环氧氧化吲哚为起始原料，为合成与3-羟基氧化吲哚相关的手性邻二醇提供了一条可规模化、高效且对映互补的路径。
本研究的科学价值和应用价值均十分显著。在科学上，它首次解决了手性3HhMOs（特别是含有螺环季碳中心的结构）的立体选择性合成难题，填补了该领域的技术空白。它深入探索并调控了HHDH在亚硝酸盐开环反应中的化学选择性（O- vs N-进攻）和对映选择性，拓展了对此类酶催化机制的理解和应用边界。同时，发现并表征了新型高选择性环氧化物水解酶PleH2，丰富了可用于合成空间位阻底物的酶工具箱。在应用上，该平台提供了一种高效、绿色（生物催化、原子经济性较好、使用温和条件）的合成方法，能够以高收率和高光学纯度获得两个对映体，这对于药物发现中的构效关系研究和候选药物制备至关重要。克级规模的合成成功和衍生化实验展示了其实际应用的潜力。
本研究的亮点在于：第一，方法学的首创性。 这是首例报道的立体选择性合成手性3-羟基-3-羟甲基氧化吲哚的方法，具有里程碑意义。第二，策略的巧妙性。 创造性地结合了两种功能互补的酶（HHDH和EH），通过“动力学拆分 + 对映特异性转化”的策略，巧妙地实现了从单一外消旋原料出发，高效制备两个对映体纯产物的目标，最大限度地利用了原料。第三，催化剂的高性能。 通过理性的蛋白质工程改造，获得了性能显著提升的HheC-SM8突变体；并通过筛选，发现了高效且高选择性的新型PleH2酶。第四，广泛的底物普适性。 该平台能够兼容多种不同位置、不同类型取代基的底物，证明了其强大的适用性。第五，展示了实际应用潜力。 高浓度底物实验、克级制备以及成功的衍生化转化，都表明该平台具有良好的可扩展性和实用价值，不仅仅停留在实验室概念验证阶段。这项研究是生物催化在复杂手性分子合成中成功应用的典范，为药物化学和相关领域提供了强有力的新工具。