一项针对高血压血管内皮损伤修复的新机制与潜在治疗靶点的研究
一、 研究团队、发表信息与学科背景
本研究由Chao Li、Lin Lin、Lei Zhang、Ran Xu、Xiaoqing Chen、Jingkang Ji和通讯作者Yunlun Li*共同完成。研究团队主要来自山东中医药大学（Shandong University of Traditional Chinese Medicine）的创新中药研究院、实验中心、第一临床医学院及其附属医院，以及济南市天桥区人民医院。该项研究成果于2021年10月1日在线发表在药理学领域的知名期刊 《Pharmacological Research》 第173卷，文章编号为105920。
本研究属于心血管药理学与血管生物学交叉领域。高血压是全球范围内最常见的心血管疾病风险因素之一，其病理过程与血管内皮功能障碍密切相关。血管内皮损伤后，如何有效修复是高血压治疗的关键科学问题。内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）作为内皮细胞的前体细胞，在血管内皮损伤后的再内皮化和血管新生中扮演着至关重要的“修复者”角色。然而，大量研究表明，高血压患者外周循环中的EPCs数量显著减少，功能受损。这种现象严重削弱了机体自身的内皮修复能力，加速了血管病变进程。血管紧张素II（Angiotensin II, AngII）是高血压血管损伤的主要介质。此外，自噬（Autophagy）作为一种维持细胞内稳态的核心降解与循环利用过程，在心血管疾病中的作用日益受到关注，但其在高血压相关EPC损伤中的具体角色尚不明确。同时，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）作为重要的表观遗传调控分子，在包括自噬在内的多种细胞过程中发挥关键作用，其中lncRNA-p21在心血管系统中的功能已有初步探索，但对其是否参与调控高血压下的EPC损伤与自噬，则知之甚少。
基于以上背景，本研究旨在深入探究高血压状态下EPC损伤与自噬水平的变化，并阐明lncRNA-p21是否通过调控特定的分子信号通路影响EPC的自噬活性，进而改善AngII诱导的EPC损伤及其血管修复功能。研究目标明确指向寻找逆转高血压EPC功能障碍的新机制和潜在治疗靶点。
二、 详细的研究工作流程
本研究设计严谨，流程复杂，整合了临床样本分析、体外细胞实验和体内动物模型验证三个层面。
第一部分：临床观察与基础验证（Procedure 1-2） 1. 研究对象与样本量：研究纳入了30名原发性高血压患者（男女各15人，平均年龄62.43±5.38岁）和30名健康对照者（男14人，女16人，平均年龄59.67±4.97岁）。所有参与者均知情同意，研究方案获得伦理委员会批准。 2. 实验方法与流程： * 外周血EPC数量与表型分析：采集受试者外周血，利用多色流式细胞术检测EPC标志物。将CD34+CD133+细胞定义为早期EPCs，CD34+KDR+细胞定义为晚期（成熟）EPCs。通过计数单位数量有核细胞中的阳性细胞比例，比较两组人群EPC的数量和成熟度比例。 * 原发性人EPC的功能学评估：从高血压患者和健康对照者的外周血中分离并原代培养EPCs。随后，通过以下实验评估细胞功能： * 粘附实验：将EPCs接种于纤连蛋白包被的孔板，培养1小时后，固定染色，计数粘附细胞数。 * 迁移实验（Transwell）：将EPCs置于Transwell小室的上室，下室加入趋化培养基，培养6小时后，对迁移至下室的细胞进行固定、染色和计数。 * 体外成管实验：将EPCs接种于基质胶（BME）上，培养6小时后，观察并计数形成的管状结构，评估其血管生成潜能。 3. 数据分析：流式数据使用Cytexpert软件分析，功能学实验数据进行组间t检验或ANOVA分析。
第二部分：体外机制探究（Procedure 3-5） 1. 研究对象：从健康雄性Wistar大鼠（4-6周龄）的骨髓中分离、培养原代大鼠EPCs。 2. 实验流程与关键方法： * AngII诱导的EPC衰老与lncRNA-p21表达：用AngII处理大鼠EPCs，诱导细胞损伤模型。通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老；通过实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别检测lncRNA-p21和p53的表达变化。 * lncRNA-p21的功能获得（Gain-of-function）研究：为了探究lncRNA-p21的作用，研究构建了过表达lncRNA-p21的腺病毒（Adenovirus, Adv），并转染至EPCs中。随后，在AngII存在或不存在的情况下，评估： * 细胞衰老：SA-β-gal染色。 * 细胞功能：粘附、迁移、成管实验。 * 分子机制通路：通过Western Blot检测Sestrin2 (SESN2)、AMPK及其磷酸化（p-AMPK）、TSC2及其磷酸化（p-TSC2）、mTOR及其磷酸化（p-mTOR）、自噬相关蛋白（LC3II, Beclin-1, p62）的表达。通过免疫荧光染色观察SESN2的蛋白定位和表达强度。 * 自噬流检测： * 透射电镜（TEM）：直接观察细胞内自噬体（Autophagosome）和自噬溶酶体（Autolysosome）的形态和数量。 * mRFP-GFP-LC3双标腺病毒：这是一种先进的自噬流示踪技术。该融合蛋白在酸性环境中（自噬溶酶体）GFP荧光淬灭而呈现红色斑点（mRFP+），在中性环境中（自噬体）同时呈现黄色斑点（mRFP+GFP+）。通过共聚焦显微镜观察红点与黄点的比例和数量，可以动态评估自噬流的强弱。 * 通路抑制验证：为了确认AMPK通路的关键作用，在过表达lncRNA-p21的同时，使用AMPK的特异性抑制剂Compound C处理细胞，然后再次检测mTOR磷酸化、自噬水平（通过上述多种方法）以及细胞衰老表型。
第三部分：体内功能验证（Procedure 6-7） 1. 研究对象与模型：使用7周龄雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats, SHRs）建立血管球囊损伤（Vascular Balloon Injury, VBI）模型，模拟血管内皮损伤。 2. 实验流程： * lncRNA-p21的功能缺失（Loss-of-function）研究：首先，利用腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）构建敲低lncRNA-p21的大鼠EPCs，标记为EPCs(+)；对照病毒转染的EPCs标记为EPCs(-)。 * 细胞回输与体内修复评估：将上述两种EPCs分别通过尾静脉注射给接受了VBI手术的SHRs。术后评估： * EPC归巢与定位：通过免疫荧光共染色，检测损伤血管段内绿色荧光蛋白（GFP，标记转染的EPCs）和内皮标志物CD31的共定位情况，以及CD34+/CD133+ EPCs的存在情况，直观反映EPC在损伤部位的粘附与募集能力。 * 血管组织学修复：取损伤的颈总动脉进行苏木精-伊红（HE）和马松（Masson）染色，评估内皮层完整性、内膜增生和血管结构。 * 血管功能检测：通过离体血管环张力实验，分别使用乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）刺激，评估血管内皮依赖性和非依赖性舒张功能。 * 血清生物标志物：检测血清一氧化氮（NO，血管舒张因子）和内皮素-1（ET-1，血管收缩因子）的含量。 3. 数据分析：体内实验数据同样采用相应的统计学方法进行组间比较。
三、 主要研究结果
结果一：高血压患者EPCs数量减少且功能受损。 流式细胞术结果显示，高血压患者外周血中早期EPCs（CD34+CD133+）和总EPCs数量均显著低于健康对照。同时，晚期EPCs的比例升高，提示EPC群体向衰老/终末状态偏移。功能学实验证实，从高血压患者分离培养的EPCs，其粘附、迁移和成管能力均明显下降。这些数据为高血压状态下EPC系统存在缺陷提供了直接的临床证据。
结果二：lncRNA-p21是AngII诱导EPC衰老的关键调控因子。 体外实验发现，AngII处理可导致大鼠EPCs衰老增加，同时伴随lncRNA-p21表达显著下调，而p53蛋白表达上调。这一看似矛盾的现象（p53通常激活lncRNA-p21）引出了核心科学问题。通过腺病毒过表达lncRNA-p21后，虽然p53蛋白水平本身未发生显著变化，但AngII诱导的EPC衰老被显著缓解，同时EPC的粘附、迁移和成管功能也得到了恢复。这强烈表明，lncRNA-p21的下调是AngII损害EPC的关键环节，而恢复其表达具有保护作用。同时，这也暗示lncRNA-p21可能不是通过改变p53总量，而是通过增强p53的“活性”来发挥作用。
结果三：lncRNA-p21通过SESN2/AMPK/TSC2通路抑制mTOR磷酸化。 为了探究lncRNA-p21的保护机制，研究检测了p53下游的转录靶点。已知SESN2是p53的靶基因，并能激活AMPK。实验发现，AngII降低了SESN2的表达以及AMPK和TSC2的磷酸化水平（即激活减弱），而过表达lncRNA-p21能够逆转这些效应。由于磷酸化的AMPK和TSC2可以抑制mTORC1的活性，研究者进一步发现，过表达lncRNA-p21确实降低了AngII引起的mTOR磷酸化（激活）水平。使用AMPK抑制剂Compound C后，lncRNA-p21对mTOR的抑制作用被阻断。这些结果清晰地描绘出一条分子通路：lncRNA-p21 → 增强p53转录活性 → 上调SESN2表达 → 促进AMPK/TSC2磷酸化/激活 → 抑制mTOR信号。
结果四：lncRNA-p21通过AMPK/TSC2/mTOR通路增强自噬并减轻EPC衰老。 鉴于mTOR是自噬的关键负调控因子，研究者紧接着评估了自噬水平。透射电镜结果显示，AngII处理减少了EPCs中的自噬体/自噬溶酶体数量，而过表达lncRNA-p21则显著增加了其数量，此效应可被Compound C抑制。mRFP-GFP-LC3双标实验提供了更动态的证据：AngII处理减少了红色（自噬溶酶体）和黄色（自噬体）斑点的数量，表明自噬流减弱；过表达lncRNA-p21增加了两者数量，表明自噬流增强；Compound C则削弱了这一增强作用。Western Blot检测自噬标志物（LC3II增加、p62减少）的结果与上述观察一致。最重要的是，当使用Compound C抑制自噬后，lncRNA-p21对AngII诱导的EPC衰老的保护作用也相应减弱。这表明，lncRNA-p21是通过增强自噬来发挥其抗衰老和保护功能的。
结果五：敲低lncRNA-p21损害EPCs在体内的血管修复能力。 体内实验提供了最终的功能验证。在SHRs的颈总动脉VBI模型中，回输敲低了lncRNA-p21的EPCs(+)与对照EPCs(-)相比，表现出更差的归巢能力（损伤血管段GFP+细胞和CD34+/CD133+细胞更少）。组织学显示，EPCs(+)组血管内皮损伤修复更差，内膜增生更明显。血管功能检测表明，EPCs(-)能够显著改善VBI手术导致的内皮依赖性舒张功能障碍，并提高血清NO水平、降低ET-1水平；而EPcs(+)的这些改善作用均不显著或消失。非内皮依赖性舒张功能在各组间无差异，说明修复作用特异于内皮。这些结果强有力地证明，lncRNA-p21对于维持EPCs的体内血管修复功能是必需的。
四、 研究结论与意义
本研究得出明确结论：在高血压状态下，AngII诱导的EPC衰老和功能障碍与自噬水平下降密切相关。lncRNA-p21作为一个关键的保护性分子，通过促进p53的转录活性，上调SESN2表达，进而激活AMPK/TSC2通路，抑制mTOR信号，最终增强EPC的自噬活性，从而对抗AngII的损伤作用，改善EPC功能并促进其在体内的血管修复。
科学价值： 1. 阐明了新机制：首次系统揭示了“lncRNA-p21 — SESN2/AMPK/TSC2 — 自噬”这一轴心通路在保护高血压EPC损伤中的核心作用，将非编码RNA调控、代谢应激感应（AMPK）和细胞自噬三大生物学过程有机连接，为理解高血压血管病变的细胞分子机制提供了全新的视角。 2. 确立了新靶点：将lncRNA-p21确立为改善高血压内皮损伤和EPC功能障碍的潜在治疗靶点。与直接干预蛋白质相比，靶向lncRNA可能提供更具特异性和可调性的治疗策略。 3. 深化了自噬在心血管领域的作用认知：为“适度增强自噬具有心血管保护作用”这一观点提供了来自EPC层面的有力证据，特别是在高血压这一特定病理背景下。
应用价值：该研究为开发基于lncRNA-p21或其下游通路（如AMPK激动剂）的新型药物或基因治疗策略，以修复高血压患者血管内皮、延缓动脉粥样硬化等并发症，提供了坚实的理论基础和实验依据。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究在讨论部分也客观指出，自噬在EPC功能中的作用可能存在“双刃剑”效应，适度自噬有益，而过度的自噬可能有害。本研究聚焦于AngII导致的“自噬减弱”及其修复，这为理解自噬在不同刺激和病理环境下的复杂角色增添了重要一环。作者也提到，未来需要进一步的临床研究来验证lncRNA-p21在人体高血压治疗中的效果，这体现了严谨的科学态度。此外，该研究获得了中国国家自然科学基金、山东省自然科学基金等多个项目的支持，显示了其重要性和受到的学术关注。