You Zhang（Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases, Emory University School of Medicine）、Juan Carlos de la Torre（Department of Immunology and Microbiology, The Scripps Research Institute）以及 Gregory B. Melikyan（Emory University School of Medicine 及 Children’s Healthcare of Atlanta）合作的研究《Human LAMP1 accelerates Lassa virus fusion and potently promotes fusion pore dilation upon forcing viral fusion with non-endosomal membrane》于2022年8月15日发表在 PLOS Pathogens 上。该研究聚焦于拉沙病毒（Lassa virus, LASV）进入宿主细胞的膜融合机制，特别是人源溶酶体相关膜蛋白1（human LAMP1, hLAMP1）在病毒融合孔形成与扩张过程中的具体作用。

拉沙病毒是一种旧世界哺乳动物沙粒病毒（Old World mammarenavirus），其细胞入侵主要由病毒表面糖蛋白复合物（glycoprotein complex, GPC）介导。GPC由表面亚基GP1和跨膜亚基GP2组成，GP1负责与细胞表面受体α-肌营养不良聚糖（alpha-dystroglycan）结合，GP2则介导膜融合。病毒经内吞进入晚期内体/溶酶体后，在低pH环境下GPC发生构象变化，并与胞内受体LAMP1结合，从而触发病毒包膜与内体膜的融合。然而，已有研究表明hLAMP1并非拉沙病毒融合所绝对必需，因为缺乏人LAMP1的细胞仍可支持低水平的病毒感染。此外，拉沙病毒GPC介导的融合还受到晚期内体脂质双（单酰基甘油）磷酸（bis(monoacylglycero)phosphate, BMP）的调控。BMP主要促进融合孔的形成与扩张，但hLAMP1是否在融合后期也发挥作用并不清楚。本研究旨在利用单病毒成像和群体水平融合/感染实验，系统解析hLAMP1在拉沙病毒融合孔启动与完全扩张中的作用，特别是在非内体膜系统中，通过低pH强制病毒与质膜融合，以排除其他内体因子的干扰，从而揭示hLAMP1的独立功能。

研究团队首先构建了稳定表达野生型hLAMP1（LAMP1-wt）和缺失内吞信号、主要定位于细胞表面的突变体LAMP1-D384的人肺上皮A549细胞和鸡胚成纤维DF-1细胞。A549细胞天然表达内源性hLAMP1，而DF-1细胞表达不能支持拉沙病毒进入的禽源LAMP1同源蛋白。免疫荧光染色证实A549细胞存在基础水平的hLAMP1，而DF-1细胞中未检测到该蛋白；转导后，LAMP1-wt主要分布于胞内区室，LAMP1-D384则显著表达于细胞表面。随后，作者使用携带拉沙病毒GPC的HIV-1假病毒（LASVpp）、拉沙病毒样颗粒（LASV-VLP）以及表达拉沙病毒GPC的重组淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV-LASV GPC）等多种平台，比较了内体途径和低pH强制融合途径下的融合效率和感染力。内体途径实验中，LASVpp与细胞在低温结合后转移至37°C启动内吞融合；强制融合实验则在巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）预处理以阻断内体酸化后，将结合在细胞表面的病毒暴露于pH 5.0缓冲液，直接触发质膜融合。融合效率通过病毒携带的β-内酰胺酶（beta-lactamase, BlaM）报告系统检测，该酶在病毒核心释放入胞浆后切割底物CCF4-AM，产生荧光比率变化。单病毒成像实验则采用mCherry-2xCL-YFP-Vpr双标记策略：YFP-Vpr与病毒核心结合并作为pH敏感探针，mCherry作为可扩散的内容物标记。当病毒进入酸性内体后，YFP信号淬灭；若病毒膜发生通透化，腔内pH降低，YFP进一步淬灭；当融合孔打开并与胞浆相通后，pH恢复使YFP去淬灭，同时mCherry通过足够大的融合孔释放。通过追踪YFP去淬灭与mCherry丢失之间的时间差，研究者能够区分小融合孔形成与融合孔的初步扩张。此外，作者还表达并纯化了可溶性hLAMP1胞外域（sLAMP1），在强制融合实验中加入该蛋白以检验hLAMP1跨膜结构域对融合孔扩张的作用。

群体水平实验结果显示，过表达LAMP1-wt或LAMP1-D384仅使A549和DF-1细胞中的LASVpp内体融合和感染效率提高约3倍，说明内源性hLAMP1水平在A549细胞中可能已接近最优，而DF-1细胞中可能存在其他内体辅助因子弥补LAMP1缺失。相比之下，低pH强制融合途径中，过表达hLAMP1使A549细胞的融合效率提高约120-160倍，使DF-1细胞提高约30倍；强制融合后的感染力也显著增强。LAMP1-D384由于更多定位于质膜，其促进作用较LAMP1-wt更强。LASV-VLP和重组LCMV-LASV GPC实验均显示类似趋势：内体融合/感染仅适度促进，强制融合/感染则大幅增强。对照实验表明，表达hLAMP1并不促进携带水疱性口炎病毒G蛋白（VSV G）的假病毒融合，排除了hLAMP1对膜融合的非特异性全局影响。单病毒成像显示，无论DF-1细胞是否表达hLAMP1，无论融合发生在内体还是质膜，所有LASVpp融合事件均为II型融合，即病毒膜在融合孔打开前先发生通透化，表现为YFP信号先淬灭再在融合后去淬灭。在内体融合实验中，约15%的细胞结合颗粒发生YFP淬灭，且淬灭比例与动力学不受hLAMP1表达影响；但hLAMP1过表达使小融合孔形成的速率提高约2倍，并使病毒腔内酸化至小孔形成之间的平均时间从约18分钟缩短至约8分钟。然而，hLAMP1表达并未显著改变内体融合中mCherry释放的时间延迟或“瞬时”扩张孔的比例，表明hLAMP1在内体途径中主要加速融合起始，而对融合孔扩张的促进作用有限。在质膜强制融合实验中，单病毒融合动力学较内体途径快得多，hLAMP1表达使小孔形成速率提高约5倍，但整体小孔形成事件数量的增加并不显著。更重要的是，hLAMP1表达显著缩短了YFP去淬灭与mCherry释放之间的延迟：在对照DF-1细胞中平均延迟为3.9分钟，而在表达LAMP1-wt和LAMP1-D384的细胞中分别缩短至1.2分钟和0.6分钟。同时，表达hLAMP1的细胞中“瞬时”mCherry释放事件的比例显著升高，说明hLAMP1在质膜融合中促进了新生融合孔的初步扩张。进一步使用sLAMP1的实验发现，虽然sLAMP1能加速强制融合的小孔形成并略微缩短mCherry释放延迟，但其促进“瞬时”孔扩张的能力明显弱于全长hLAMP1，且不能提高BlaM报告系统的整体融合效率。这提示hLAMP1的跨膜结构域可能在融合孔充分扩张和病毒核糖核蛋白释放过程中发挥重要作用。

综合上述结果，研究提出以下模型：拉沙病毒在缺乏hLAMP1的情况下仍可在酸性条件下形成小融合孔，但这些孔通常无法有效扩张至允许病毒核心释放的尺寸；在内体途径中，BMP等内体特异性因子可以促进融合孔扩张，因此过表达hLAMP1对最终感染的促进作用有限。然而，当病毒在质膜上被低pH强制触发融合时，由于缺乏BMP等晚期内体脂质辅助因子，融合孔扩张成为限速步骤，此时hLAMP1的作用被急剧放大。hLAMP1不仅加速GPC构象变化和小孔形成，还能促进融合孔从纳米级孔向更大的功能性孔转化，而该后一步骤可能依赖其跨膜结构域。该研究的核心意义在于：第一，建立了将病毒融合重定向至非内体膜以解析宿主因子在融合后期作用的可行策略；第二，揭示了hLAMP1在拉沙病毒融合中的双重功能——加速融合起始和促进融合孔扩张，并区分了其加速起始作用（可由可溶性胞外域部分模拟）与促扩张作用（需要跨膜锚定）；第三，单病毒成像方法实现了对小融合孔形成与初步扩张的实时分辨，为研究其他病毒融合孔动力学提供了技术参考。此外，该工作提示在评估抗拉沙病毒药物时，若仅依赖内体融合体系，可能低估靶向LAMP1-GPC相互作用的抑制剂在低表达BMP或不含其他辅助因子的膜环境中的潜在效力。