本研究由Manon Thierry（巴黎脑研究所/纽约大学格罗斯曼医学院）、Dominique Leitner、Kaleah Balcomb、Tomas Kavanagh、Lauren Tang、Evgeny Kanshin、Christopher William、Derek Oakley、Bradley Hyman、Beatrix Ueberheide、Eleanor Drummond和Thomas Wisniewski等学者合作完成，通讯作者为Manon Thierry和Thomas Wisniewski。该研究发表于Acta Neuropathologica（2026年）第152卷第13期，论文标题为“Proteomic comparison of hippocampal neurofibrillary tangles in PART, intermediate Alzheimer’s disease and advanced Alzheimer’s disease”。研究团队主要来自纽约大学格罗斯曼医学院神经病学系、巴黎脑研究所、悉尼大学脑与心智中心以及麻省总医院等机构。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）以神经元内磷酸化tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）和细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）沉积为两大核心病理特征。tau病理按照Braak分期从内嗅皮层向海马和新皮层逐步扩展，而Aβ病理则按Thal分期从新皮层向海马、基底节等区域进展。在老年人群中，常可观察到tau病理仅局限于海马结构、且不伴有Aβ沉积的病例，这类情况被称为“原发性年龄相关性tau蛋白病”（primary age-related tauopathy, PART）。关于PART究竟是一种独立疾病实体还是AD连续谱系的早期阶段，学界长期存在争议。既往神经病理和结构生物学研究提示PART与AD的tau纤维在形态和生化特征上高度相似，但临床进展速度和认知损害模式存在差异；同时，有研究发现PART和AD的缠结相关蛋白组可能存在不同特征，但缺乏无偏倚的系统性比较。因此，本研究旨在利用无偏倚的蛋白组学策略，系统比较PART、中度AD和重度AD海马神经原纤维缠结的蛋白组组成，以阐明Aβ病理对缠结蛋白组的修饰作用及其在tau病理扩展中的潜在机制。

研究纳入了18例尸检人脑样本，根据ABC评分分为三组：PART组（A0, B1–2, C0；n=6）、中度AD组（A1–2, B2–3, C1–2；n=6）和重度AD组（A3, B3, C3；n=6）。所有病例均无显著TDP-43病理，且排除了其他原发性tau蛋白病；为扩大样本量，部分病例合并路易体病但分布均衡。研究流程包括以下几个关键步骤。第一，免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）评估：对海马石蜡切片进行抗Aβ（4G8）、抗tau pSer202/pThr205（AT8）、抗tau pThr217和抗tau pThr231染色，利用Aperio Versa 8扫描仪和ImageScope软件定量各海马亚区（CA4、CA3、CA2、CA1和下托）的Aβ沉积面积百分比及tau免疫阳性像素百分比，并通过双因素方差分析和Tukey多重比较检验进行组间比较。第二，激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）：利用AT8染色显示缠结，在LCM兼容的PET框架玻片上手动切割AT8阳性神经元轮廓作为“tangle”样本，同时切割邻近神经毡的等面积区域作为“non-tangle”内部对照样本。每例每种样本类型收集1.5 mm²总面积，平均对应726.8个手动切割对象；由于水分蒸发限制，分三次各收集0.5 mm²。该步骤是本研究的核心技术特色之一，将免疫组化与LCM结合实现了对缠结的精确定位采集。第三，蛋白质提取与酶解：采用酸提取和加速酶解工作流程（SPEED法），以100%三氟乙酸在73°C提取蛋白，再用Tris碱中和并加入胰蛋白酶37°C消化过夜，随后用Evosep Pure C18吸头脱盐浓缩。第四，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据采集：使用Evosep One液相系统与Bruker timsTOF HT质谱仪联用，采用数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）结合平行累积-串行碎裂（diaPASEF）模式，MS1扫描范围为400–1200 Da，离子淌度范围为0.6–1.6 1/K₀，每个DIA周期包含一个MS1 frame和多个diaPASEF MS/MS frames，总循环时间约1.8秒。第五，数据分析：质谱原始数据用Spectronaut软件以directDIA模式进行无库检索，胰蛋白酶特异性允许最多1个漏切位点，蛋氨酸氧化为可变修饰，半胱氨酸氨甲酰甲基化为固定修饰，肽段、蛋白和位点水平的假发现率（false discovery rate, FDR）均设为1%，每个蛋白至少需要2条不同肽段才可被认为鉴定到。定量在MS2水平进行。剔除一个异常离群病例（case 6，PART组）后，对LFQ蛋白强度值进行log2转换、中位数归一化和基于正态分布的缺失值填补。组内“tangle”与“non-tangle”样本采用配对t检验，组间“non-tangle”样本采用非配对t检验，显著富集蛋白标准为倍数变化（fold change, FC）≥1.5且p值<0.05。蛋白相互作用网络和功能富集分析在STRING 12.0和Cytoscape 3.10.2中进行，使用Gene Ontology“分子功能”和“生物学过程”术语，置信度评分0.70，排除文本挖掘证据，聚焦物理相互作用，冗余度截止值0.25。

研究结果显示，免疫组化定量分析未发现Aβ和tau病理在海马亚区分布上存在显著组间差异，但tau免疫阳性物质随组别递增，且三种pTau表位在CA4、CA3受累最轻而在CA2、CA1和下托受累更重，支持tau病理在组间呈连续演变而非截然不同的病理特征。蛋白组学共检测到2413种蛋白，其中2310种在至少一组的一种样本类型中检测到。主成分分析显示重度AD样本与PART样本在PC1上显著分离（p<0.001），中度AD介于其间；tangle与non-tangle样本在PC2上有分离趋势但未达显著。配对t检验分别鉴定出119、111和138种蛋白在PART、中度AD和重度AD的tangle样本中显著富集（p<0.05, FC≥1.5）。tau蛋白在所有样本中均丰度较高，但未达到在tangle中显著富集的阈值，作者认为这可能与“non-tangle”样本中包含生理性tau以及提取条件偏向可溶性tau有关；然而肽段水平分析证实了tangle样本中pThr217磷酸化tau肽段的富集，验证了方法学有效性。三组共有的核心缠结蛋白组包含63种蛋白，其中17种为此前鉴定的pTau相互作用蛋白，44种在既往AD脑蛋白组数据集中有失调报道，仅CCDC124和SUGP2为首次报道。该核心蛋白网络显著富集于RNA结合（58/63种蛋白）和mRNA代谢过程调控（14/63种蛋白），提示RNA加工相关通路在缠结形成中的普遍作用。此外，PART特异的缠结蛋白有33种，主要富集于“结构分子活性”（10/33种蛋白），涉及核糖体结构完整性（RPL27A、RPL3、RPS15A、RPS3A、RPS14）、细胞-细胞外基质相互作用（LAMB2、NID1）和蛋白水解调控（PI3、TINAGL1）。其中12种蛋白在AD脑蛋白组数据库中未见报道（AASS、CPA4、HOXD10、LDB3、MCM3、NID1、PACSIN3、PI3、PLBD1、PRSS3、SPRR1A、TINAGL1）。值得注意的是，部分PART特异蛋白在AD组tangle中呈下降趋势或无法检测，如GRN、NQO1、TINAGL1在中度和重度AD中均下降，ATG5ME、MAP1LC3B2、NID1和PRSS3仅在重度AD中下降，提示这些蛋白可能参与对抗tau病理扩展的保护机制。中度AD特异的缠结蛋白有34种，其中22种为RNA结合蛋白，5种参与细胞质翻译；重度AD特异的缠结蛋白有66种，主要富集于细胞质翻译（24/66种蛋白），并包括若干在PART和中度AD中呈下降趋势的蛋白，如GSTM3、PSMD11、PSMD14、SERPINA3和CTSG等。相关分析显示，三组间“tangle vs non-tangle”倍数变化方向高度一致：PART与中度AD之间88.7%的蛋白变化方向一致（r=0.8205），中度AD与重度AD之间91.8%一致（r=0.8361），PART与重度AD之间84.3%一致（r=0.7386），表明三组缠结蛋白组共享大量共同特征，同时存在反映病理进展的特异性改变。

本研究的核心结论是：PART的神经原纤维缠结蛋白组与AD连续谱系中的缠结蛋白组高度相关，共享63种核心蛋白，但PART具有独特的蛋白组特征，主要表现在结构分子活性和与细胞防御机制相关的蛋白富集；随着Aβ病理的出现和加重，缠结蛋白组发生重塑，RNA结合和细胞质翻译通路逐渐占主导，同时部分保护性蛋白表达下降或消失。这种蛋白组重塑可能反映神经元蛋白稳态压力的增加和保护性机制的丧失，从而促进tau病理从海马向外扩展，推动从临床良性PART向症状性AD的转变。该研究为理解Aβ如何修饰tau病理微环境提供了机制性见解，并为区分PART与AD的潜在生物标志物开发以及旨在稳定老年人群tau病理的治疗策略提供了新的蛋白组学数据基础。

本研究的亮点包括：第一，采用无偏倚的定量蛋白组学方法首次系统比较了PART、中度AD和重度AD海马缠结蛋白组，填补了该领域缺乏全谱系比较的空白；第二，将激光捕获显微切割与DIA质谱联用，实现了对缠结的精确定位和深度蛋白组覆盖，同时利用邻近神经毡作为内部控制，减少了微环境混杂因素；第三，鉴定出63种核心缠结蛋白和组特异性蛋白，特别是发现GRN、NQO1等保护性蛋白在PART中富集而在AD中下降，为tau病理扩展的“保护机制丧失”假说提供了蛋白组学证据；第四，研究还纳入了多种pTau表位（pSer202/pThr205、pThr217、pThr231）的免疫组化定量，从组织学层面支持PART与AD的连续性。研究也存在局限性，包括样本量较小（每组5–6例）、使用非缠结区域而非无缠结神经元作为对照、提取条件可能低估不可溶性tau的贡献等，作者在讨论中予以充分说明。