CXCL5/CXCR2轴与溃疡性结肠炎中性粒细胞炎症相关性的综合解析：一项整合eQTL、pQTL与转录组数据的孟德尔随机化研究学术报告

一、 研究团队、发表期刊与时间 本研究由浙江大学医学院附属邵逸夫医院中医科的冯奕奕、潘虹、董苗霞、莫剑林*（通讯作者）以及上海中医药大学附属龙华医院消化科的许逸川、单婧怡、郭恩嘉、林江合作完成。研究论文“CXCL5/CXCR2 axis related to neutrophilic inflammation in ulcerative colitis: a comprehensive analysis integrating eqtl, pqtl, and transcriptome data”发表于学术期刊 *Current Medicinal Chemistry*，于2025年2月11日投稿，同年7月11日被接受。

二、 研究学术背景 溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是炎症性肠病的主要亚型，其特征是结肠黏膜和黏膜下层的慢性炎症，并伴有反复的复发与缓解。尽管其确切发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明免疫失调在其进展中起着核心作用。免疫细胞（如T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等）浸润肠道，释放多种炎症细胞因子，导致持续的结肠炎症。虽然针对特定炎症细胞因子（如肿瘤坏死因子-α、α4β7整合素、IL-¹²⁄₂₃ p40）的分子靶向疗法已革新了UC的治疗，但仍有相当比例（20%-60%）的患者在诱导期无法达到临床应答，这凸显了深入理解UC炎症过程的迫切性。

既往小规模研究揭示了特定趋化因子和白介素在结肠炎发生发展中的关键作用，但缺乏基于大规模人群的、阐明这些炎症细胞因子在UC发病机制中确切作用和机制的综合临床研究。近年来，大规模基因组学、转录组学和蛋白质组学数据的整合，特别是表达数量性状位点（Expression Quantitative Trait Loci, eQTL）和蛋白质数量性状位点（Protein QTL, pQTL）研究的进展，为在流行病学规模上剖析复杂疾病的分子基础提供了宝贵工具。

本研究旨在通过整合eQTL、pQTL和转录组数据，并运用孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）、共定位分析及生物信息学分析等多种方法，系统探索与UC存在因果关联的炎症因子，并深入解析其潜在的病理生理机制，以期为未来临床转化和个体化治疗策略提供科学依据。

三、 详细研究流程与方法 本研究设计严谨，采用了多阶段、多数据源整合的分析策略，主要流程包括数据获取、遗传关联分析、生物信息学验证和实验验证四个主要部分。

第一部分：数据获取与遗传工具变量筛选 1. 数据来源： * 暴露数据：循环炎症细胞因子水平的pQTL数据来源于一项涵盖11个独立队列、14,824名欧洲血统参与者的全基因组pQTL研究，涉及91种炎症介质。炎症细胞因子的eQTL数据来自eQTLgen联盟，该研究基于31,684名欧洲血统参与者的血液样本，提供了16,987个基因的eQTL数据，本研究专注于基因起始和终止位点上下游5kb范围内的顺式eQTL。 * 结局数据：UC的汇总数据来自两个独立的队列。探索队列数据来自一项包含12,366名UC患者和33,609名对照（主要为欧洲血统）的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）。验证队列数据来自FinnGen数据库（第10轮），包含5,931例住院UC患者和405,386名对照。 2. 单核苷酸多态性（SNP）选择与质量控制：为确保孟德尔随机化假设的有效性，研究进行了严格的质控。首先，选取与炎症细胞因子显著相关（P < 5×10^-6）的SNP作为工具变量。其次，为避免连锁不平衡，在10 Mb窗口内以r^2 < 0.1为标准对SNP进行修剪。随后，排除与已知混杂因素（如吸烟、饮酒、抑郁、抗生素使用）相关的SNP以及位于主要组织相容性复合体（MHC）区域的SNP。计算每个SNP的F统计量，剔除F < 10的弱工具变量。最后，排除与UC直接相关的SNP，并仔细对齐效应等位基因以排除回文SNP。

第二部分：遗传关联与因果推断分析 1. 孟德尔随机化分析：采用两样本MR方法评估炎症细胞因子水平与UC风险之间的潜在因果关系。主要分析方法为逆方差加权法（Inverse Variance Weighted, IVW），同时使用加权中位数法（Weighted Median, WM）和MR-Egger法作为补充和敏感性分析。为控制多重比较导致的假阳性，使用Benjamini-Hochberg（B-H）方法校正P值，校正后P < 0.05被认为具有统计学意义。仅在探索和验证队列中均得到验证的炎症细胞因子才被视为显著靶标。 2. 敏感性分析：为评估结果的稳健性，进行了系列敏感性检验。使用Cochran‘s Q检验评估异质性；使用MR-Egger截距检验评估多效性；进行留一法分析以检验结果是否受单个SNP驱动。 3. 共定位分析：使用“coloc”R包进行贝叶斯共定位分析，以探究暴露（细胞因子水平或表达）与结局（UC）之间是否共享相同的因果遗传变异。后验概率PP.H4 > 0.8被认为是支持共定位的有力证据。这有助于排除由连锁不平衡驱动的弱因果关联。

第三部分：生物信息学分析与机制探索 1. 转录组数据收集与差异表达分析：从基因表达综合数据库下载UC的批量RNA测序数据（数据集GSE66407，包含62个UC样本和99个对照样本）。使用“limma”R包识别差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），筛选标准为校正后P值 < 0.05且|log2(倍数变化)| ≥ 1.0。此外，还利用数据集GSE12251（包含12例英夫利西抗应答者和10例非应答者）探索候选靶点在药物耐药中的作用。 2. 功能富集分析：基于CXCL5表达高低对UC患者进行分组，识别组间DEGs。使用“clusterProfiler”R包对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，以了解CXCL5相关的生物学过程和信号通路。 3. 基因集富集分析：使用GSEA分析，从通路水平探究与CXCL5表达相关的协调性变化。 4. 免疫细胞浸润评估：使用CIBERSORT方法将肠道基因表达数据转化为免疫细胞浸润程度。通过Spearman相关分析和Mantel检验评估CXCL5/CXCR2轴表达与免疫细胞浸润程度之间的相关性。

第四部分：实验验证 1. 组织样本：收集了上海龙华医院的6例结肠癌患者手术切除的正常结肠组织样本和6例UC患者内镜活检组织样本。所有参与者均签署了知情同意书，研究获得了医院伦理委员会的批准。 2. 免疫组织化学染色：组织标本经福尔马林固定、石蜡包埋、切片。经过脱蜡、水化、抗原修复、血清封闭等步骤后，使用针对CXCL5和CXCR2的一抗（分别为1:100和1:250稀释）在4°C孵育过夜。使用辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色，苏木精复染。在光学显微镜下观察并采集图像。 3. 定量分析：使用ImageJ（Fiji）软件，通过“colour deconvolution”插件选择DAB特异性通道，计算平均光密度（Average Optical Density, AOD）以量化目标蛋白表达。

四、 主要研究结果 1. 蛋白质组范围MR分析识别与UC有因果关联的炎症蛋白：在探索阶段，IVW方法初步发现了20种与UC存在潜在遗传关联的循环炎症蛋白。经B-H校正后，筛选出10个可能影响UC风险的候选蛋白。其中，腺苷脱氨酶、CCL4、CD6、CXCL9、IL-12β亚基和TNF的循环水平与UC风险呈正相关，而CD40L受体、Cystatin D、CXCL5和磺基转移酶1A1的循环水平与UC风险呈负相关。敏感性分析显示部分细胞因子的SNP存在异质性，IL-12β亚基的MR估计可能受多效性干扰。在验证阶段，91种炎症蛋白中有9种与UC的关联得到验证。最终，CXCL5、CCL4和CD6在探索和验证队列中均得到重复，且未发现多效性干扰（IL-12β因多效性被排除）。留一法分析证实了这些因果估计的稳健性。 2. 共定位分析确认CXCL5与UC共享因果遗传变异：使用探索队列的pQTL和UC GWAS数据进行共定位分析。结果显示，CXCL5与UC之间存在强有力的共定位证据（PP.H4 = 0.985），关键SNP rs425535驱动了这一因果关联。然而，CCL4和CD6与UC并未显示出共享的遗传结构（PP.H4 < 0.8）。这进一步支持了CXCL5在UC病因学中的特异性作用。 3. CXCL5/CXCR2轴的mRNA表达与UC存在因果关联：利用eQTL数据，研究发现CXCL5及其受体CXCR2的mRNA表达与UC在探索和验证队列中均存在显著的遗传关联。敏感性分析排除了多效性和异质性的影响。共定位分析进一步证实，CXCL5和CXCR2的eQTL与UC共享共同的因果遗传变异。值得注意的是，CXCL5的pQTL和eQTL与UC共定位的因果变异均为rs425535，这从基因转录到蛋白质水平强化了CXCL5在UC中的致病作用。 4. CXCL5/CXCR2轴参与肠道炎症发展：转录组分析显示，在UC患者的炎症肠道中，存在大量差异表达基因。CXCL5和CXCR2在结肠组织中的表达显著上调且呈正相关，证实了UC中存在异常的CXCL5/CXCR2轴。此外，CXCL5的表达与中性粒细胞标志物CD11b和CD18的表达呈显著正相关，提示CXCL5可能参与UC中中性粒细胞向肠道的过度迁移。 5. CXCL5的功能富集分析揭示其与中性粒细胞趋化及炎症通路相关：根据CXCL5表达水平将UC患者分组后，共鉴定出196个DEGs。GO富集分析显示，这些DEGs主要富集于中性粒细胞趋化、白细胞迁移等生物学过程，以及G蛋白偶联受体结合、细胞因子活性、趋化因子受体结合等分子功能。KEGG通路分析表明，CXCL5不仅驱动趋化因子信号通路，还与TNF、NF-κB、IL-17等炎症信号通路相关。GSEA分析进一步验证了CXCL5可介导趋化因子通路和炎症相关通路的激活。 6. CXCL5/CXCR2轴与中性粒细胞浸润及NETs形成相关：免疫细胞浸润分析显示，UC患者结肠组织中中性粒细胞浸润显著增加。在所有浸润的免疫细胞中，CXCL5/CXCR2的表达与中性粒细胞的相关性最强。此外，该轴也与活化的CD4+ T细胞和巨噬细胞显著相关。通过对比已知的69个中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Trap, NET）相关基因与CXCL5高低表达组间的差异基因，发现了10个交集基因，提示CXCL5/CXCR2轴不仅参与中性粒细胞的迁移和活化，还可能参与NETs的形成。 7. 人结肠组织中CXCL5/CXCR2表达的验证：免疫组化结果直观显示，与对照组相比，UC患者结肠组织中CXCL5和CXCR2的蛋白表达显著上调（P < 0.01和P < 0.001）。UC患者结肠隐窝结构扭曲、减少甚至消失，隐窝间有大量免疫细胞浸润。 8. CXCL5/CXCR2轴在药物耐药中的作用：基于英夫利西抗治疗应答数据集的探索性分析发现，非应答者组的基线CXCL5和CXCR2表达水平高于应答者组，提示该轴的高表达可能与英夫利西抗治疗失败有关。

五、 研究结论与意义 本研究通过整合多组学数据和多种生物信息学方法，并结合实验验证，系统性地证明了CXCL5/CXCR2轴与溃疡性结肠炎之间存在显著的遗传因果关联。该关联与结肠中性粒细胞的趋化和激活密切相关。CXCL5/CXCR2轴不仅直接介导中性粒细胞驱动的炎症，还通过激活IL-17、NF-κB、TNF等信号通路，并与巨噬细胞、T细胞等免疫细胞相互作用，构成复杂的炎症网络，共同促进UC的病理进程。此外，初步证据表明该轴可能与生物制剂耐药相关。

科学价值：本研究为UC的发病机制提供了新的见解，首次通过大规模遗传学证据（整合pQTL和eQTL）确立了CXCL5/CXCR2轴在UC中的因果作用，并将该轴的功能与具体的中性粒细胞浸润、活化及NETs形成等细胞生物学过程联系起来，深化了对UC中性粒细胞炎症的理解。

应用价值：研究结果突出了CXCL5/CXCR2轴作为UC潜在治疗靶点的重要价值。针对该轴的干预（例如，使用CXCR2拮抗剂或中和CXCL5抗体）可能成为治疗UC，尤其是对现有生物制剂应答不佳患者的新策略。

六、 研究亮点 1. 多维度数据整合与因果推断：创新性地将pQTL、eQTL、GWAS和转录组数据相结合，运用MR和共定位分析，从遗传层面强有力地论证了CXCL5/CXCR2轴与UC的因果关系，超越了传统观察性研究的局限性。 2. 从遗传关联到功能机制的深入探索：研究流程逻辑严密，从全蛋白组筛选到靶点验证，从遗传关联到表达差异、功能富集、免疫浸润分析，再到组织水平验证，形成了一个完整的证据链，系统阐明了CXCL5/CXCR2轴在UC中的作用机制。 3. 聚焦中性粒细胞炎症新视角：研究将遗传学发现与具体的免疫细胞类型（中性粒细胞）及其功能（趋化、活化、NETs形成）直接关联，为理解UC的免疫病理提供了新的、聚焦于中性粒细胞的角度。 4. 临床转化潜力提示：不仅发现了新的潜在治疗靶点，还通过分析公开数据集，初步探索了该靶点与临床药物（英夫利西抗）应答的相关性，为后续的转化研究指明了方向。

七、 其他有价值内容 研究在讨论部分还详细探讨了CXCL5/CXCR2轴与其他炎症通路（如IL-17、TNF、TLR、NF-κB通路）的潜在交叉对话，以及其通过中性粒细胞介导的与其他免疫细胞（如巨噬细胞、Th17细胞）的相互作用，描绘了一个更广泛的炎症调控网络图景。同时，作者也客观指出了本研究的局限性，如MR分析基于特定假设、需要进一步的功能实验验证、所用数据未区分UC的病变部位和严重程度可能带来异质性、批量RNA-seq数据可能掩盖细胞类型特异性信号、验证样本量较小等，为未来研究提供了清晰的改进方向。