本研究由Jing-Wei Zhang、Han Wang、Jing Liu、Le Ma、Rong-Hong Hua和Zhi-Gao Bu等人完成，主要作者来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室和扬州大学江苏省重要动物传染病与人兽共患病防控协同创新中心。论文发表于Virologica Sinica期刊2021年第36卷第476至489页，于2020年11月24日在线发表。
该研究属于病毒学与抗病毒药物研发领域。寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染可导致新生儿严重出生缺陷和成人吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome），但目前尚无获批的疫苗或特异性治疗药物。构建携带报告基因的寨卡病毒反向遗传系统是研究病毒复制机制和筛选抗病毒药物的重要工具，然而已有寨卡病毒报告病毒普遍存在稳定性差、报告基因在传代过程中易丢失、报告病毒复制能力减弱以及报告信号在部分细胞中观测效果不理想等问题。为解决上述问题，本研究旨在构建一种稳定且具有良好绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）可见性的寨卡病毒GFP报告病毒系统，并利用该系统建立高通量药物筛选平台，从植物来源化合物库中筛选具有抗寨卡病毒活性的候选化合物。
在具体研究流程方面，本研究首先以2015年巴西流行的寨卡病毒Paraiba_01/2015株（GenBank登录号：KX280026）基因组为参考序列，采用同源重组策略构建寨卡病毒反向遗传系统。研究者将寨卡病毒基因组的前四分之一（包含5′非翻译区、C-prM-E及NS1前134个氨基酸编码序列）克隆至pcAGneo载体中，构建了pZC38GFP-CME-NS1134质粒。为构建GFP报告病毒，研究者在病毒基因组的5′非翻译区与完整C蛋白基因之间插入了GFP编码序列、C蛋白前33个氨基酸残基编码序列和口蹄疫病毒2A（foot-and-mouth disease virus 2A, FMDV 2A）序列，其中2A序列可确保C蛋白氨基末端的正确切割。转染时，通过PCR扩增含CMV启动子和结构蛋白编码序列的DNA片段，与经XhoI线性化的复制子质粒pZIKVRepΔCME共同转染HEK-293T细胞。3天后收集上清接种Vero或BHK-21细胞，成功获得重组寨卡病毒和GFP报告寨卡病毒。重组野生型寨卡病毒在Vero细胞中72小时病毒滴度可达7.0 log PFU/mL，而GFP报告病毒在Vero细胞中GFP信号呈点状分布、不能真实反映细胞形态。为改善GFP报告病毒的增殖效率和GFP信号可见性，研究者通过转染pcAG-DC-SIGNR质粒并利用G418筛选，建立了稳定表达DC-SIGNR（dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non-integrin related protein）的BHK-DR细胞系。DC-SIGNR是寨卡病毒等黄病毒的受体，其表达可显著提高病毒对该细胞的感染效率。BHK-DR细胞感染GFP报告病毒后，GFP荧光均匀分布于整个细胞质，细胞轮廓清晰可辨，GFP荧光强度显著高于Vero细胞，且感染后48至72小时病毒滴度可维持在6.5 log TCID50/mL，细胞病变和空斑形成明显，报告病毒在该细胞中至少可稳定传代5次。利用该报告病毒系统，研究者建立了基于高内涵成像分析的高通量筛选（high-throughput screening, HTS）平台。实验流程为：在96孔板中接种BHK-DR细胞，16小时后加入化合物处理1小时，随后以MOI 0.1感染ZIKV-GFP报告病毒，48小时后加入Hoechst染色细胞核，利用PerkinElmer Operetta高内涵成像系统扫描每孔59个视野，再通过Acapella高内涵图像分析软件计算感染阳性细胞比例和总细胞数。研究者首先用已知寨卡病毒抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）和6-氮杂尿苷（6-azauridine, 6-az）验证了该高通量筛选系统的可靠性，结果氯喹的半数抑制浓度（IC50）为3.96 μmol/L，6-az的IC50为7.16 μmol/L，与先前报道的结果一致。随后，研究者利用该平台对TargetMol公司购买的974种植物来源化合物库进行了筛选，初筛化合物浓度为10 μmol/L。结果显示，31种化合物的病毒感染抑制率超过80%且细胞相对活力超过90%，被选为进一步验证的候选化合物。
在主要研究结果方面，31种化合物经过剂量依赖实验验证后，其中19种化合物的IC50低于4 μmol/L。活性最强的四种化合物分别为高三尖杉酯碱（homoharringtonine, HHT）、鸦胆子素D（bruceine D, BD）、双氢青蒿素（dihydroartemisinin, DHA）和洋地黄皂苷（digitonin, DGT），其IC50分别0.19、0.36、0.47和0.62 μmol/L。HHT和BD的半数细胞毒性浓度（CC50）分别为50.66和25.66 μmol/L，而DHA和DGT的CC50均大于100 μmol/L，说明后两者安全性窗口较宽。这四种化合物均能剂量依赖性地抑制ZIKV-GFP报告病毒感染BHK-DR细胞。研究者进一步在BHK-21细胞和人肺腺癌细胞A549中验证了四种化合物对野生型重组寨卡病毒的抑制作用。结果显示，0.5 μmol/L的HHT即可在两种细胞中将病毒E蛋白表达水平降低90%以上；BD在0.5 μmol/L浓度下也能显著降低两种细胞中病毒E蛋白水平；DGT在BHK-21细胞中需要8 μmol/L才能显著抑制病毒E蛋白表达，而在A549细胞中2 μmol/L即有效；DHA能有效抑制BHK-21细胞中寨卡病毒E蛋白表达，但对A549细胞的抑制作用较弱。为阐明四种化合物的抗病毒作用阶段，研究者进行了加药时间实验，分别检测化合物在病毒感染前1小时、感染期间（0至1小时）和感染后（1至48小时）加入时的抑制效果。结果表明，HHT、BD和DHA均在感染后加入时才能有效抑制寨卡病毒感染，说明它们作用于病毒复制的后入胞阶段。DGT在病毒预处理、细胞预处理、感染期间以及感染后各阶段均能抑制病毒E蛋白表达，提示DGT在病毒感染的早期阶段即能发挥抑制作用。DGT是一种天然的非离子型去垢剂，可能通过影响病毒或细胞膜蛋白而抑制病毒的吸附和入胞过程。
本研究的结论是：成功构建了一种基于2015年巴西寨卡病毒流行株的稳定GFP报告病毒系统，通过建立稳定表达DC-SIGNR的BHK-DR细胞系显著提高了报告病毒的复制效率和GFP信号可见性。利用该系统建立了高效可靠的高通量筛选平台，并从974种植物来源化合物中筛选出31种具有抗寨卡病毒活性的化合物。四种活性最强的化合物HHT、BD、DHA和DGT被进一步验证可抑制野生型寨卡病毒在BHK-21和A549细胞中的感染。其中HHT是FDA批准用于治疗慢性髓系白血病的药物，BD为广谱黄病毒抑制剂，DHA为FDA批准的抗疟药。HHT、BD和DHA作用于病毒复制的后入胞阶段，DGT则在病毒感染的早期阶段发挥作用。本研究为筛选寨卡病毒抑制剂提供了高效的筛选方法，所发现的活性化合物为寨卡病毒感染的治疗提供了潜在候选药物。
本研究的亮点在于：第一，通过同源重组反向遗传策略和DC-SIGNR稳定表达细胞系的建立，解决了寨卡病毒GFP报告病毒普遍存在的报告基因不稳定和复制能力弱的问题，为病毒复制研究和药物筛选提供了更为可靠的工具。第二，建立的基于高内涵成像的GFP报告病毒高通量筛选平台不需要更换培养基或添加底物，操作简便，结果可直接可视化分析。第三，筛选出的活性化合物包含两种FDA已批准药物，具有药物再利用（drug repurposing）的应用前景，为寨卡病毒抗病毒治疗提供了新的候选。该研究还揭示了HHT和BD对寨卡病毒、日本脑炎病毒和西尼罗河病毒具有广谱抗黄病毒活性，进一步拓展了这些化合物的潜在应用价值。