本文主要作者包括Enyou Jin（澳门科技大学）、Yusheng Yang、Shengjie Cong、Dengke Chen、Ruixiong Chen、Jun Zhang（通讯作者，澳门科技大学）、Yanjun Hu（通讯作者，南方医科大学南方医院）以及Weini Chen（通讯作者，澳门科技大学）。该项研究于2025年发表在Journal of Nanobiotechnology期刊上。
学术背景 该研究属于生物医学工程、纳米医学与创面修复的交叉领域，专注于解决糖尿病皮肤损伤（Diabetic Skin Injury， DSI） 这一临床难题。糖尿病创面难以愈合，严重影响患者生活质量并造成巨大的社会经济负担。尽管已有各种生物敷料被开发，但疗效不尽如人意。传统动物来源的外泌体（Exosomes）虽展现出治疗潜力，但仍面临产量低、制备繁琐、免疫原性等挑战。近年来，植物来源的外泌体因其易于获取、成本低廉和良好的生物相容性成为新兴研究方向。柠檬富含多种抗氧化和抗炎成分，但其外泌体在慢性糖尿病伤口愈合中的应用尚未见报道。同时，有效的给药策略和创面保护材料对于DSI管理至关重要。水凝胶敷料因其良好的透气性、保湿性和药物缓释能力而被广泛研究。因此，本研究旨在开发一种负载柠檬来源外泌体的新型水凝胶敷料，以期通过调控免疫微环境和促进组织再生来促进糖尿病伤口愈合。
研究流程详述 本研究是一项综合性研究，包含多个相互关联的实验流程，逻辑链条清晰。
流程一：疾病机制与治疗靶点探索 * 研究对象与样本量： 首先，研究团队使用链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ） 构建了糖尿病大鼠皮肤损伤模型。通过RNA测序（RNA-seq）技术，对实验组和空白对照组的大鼠皮肤组织样本进行分析（每组3个样本，共6个样本）。 * 实验方法与流程： 提取组织总RNA，进行质量检测（浓度>50 ng/µl， RIN>7.0）后，使用Oligo (dT)磁珠捕获mRNA并构建测序文库。利用生物信息学工具对测序数据进行分析：使用limma包进行差异基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）分析，使用WGCNA包进行加权基因共表达网络分析以获得相关模块基因，并使用clusterProfiler包进行基因本体（Gene Ontology， GO） 和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 通路富集分析。 * 网络药理学分析： 为了探究柠檬治疗DSI的潜在分子机制，研究通过中医药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM） 及相关文献检索柠檬的可能化学成分。将获得的柠檬活性成分靶点与DSI相关靶点取交集，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction， PPI）网络，并进行KEGG通路富集分析，以预测柠檬作用的关键通路。
流程二：新型水凝胶敷料的制备与表征 * 柠檬外泌体的提取与表征： 从新鲜柠檬中榨取汁液，经过多步差速离心（1000 × g, 3000 × g, 10,000 × g, 70,000 × g， 最后135,000 × g超速离心）进行提取和纯化，获得柠檬外泌体。使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy， TEM） 观察其形态，使用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis， NTA） 检测其粒径分布和Zeta电位，并通过细胞吞噬实验验证其可被巨噬细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）靶向摄取。 * 水凝胶的合成与制备： 研究制备了两种关键材料：甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl， GelMA） 和双醛淀粉（Dialdehyde Starch， DAS）。GelMA是通过在明胶上接枝甲基丙烯酸酐制备而成，并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）验证了其成功合成。最终的水凝胶（GelMA/DAS/Exo hydrogel）是将GelMA溶液、DAS溶液与柠檬外泌体（浓度20 µg/ml）混合，并在紫外光（UV）照射下交联固化制得。 * 水凝胶的性能表征： 对制备的水凝胶进行了全面的理化性质表征： 1. 化学结构： 使用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy， FTIR） 分析化学键，证实了GelMA与DAS之间成功形成了希夫碱键（-C=N-）。 2. 微观结构： 使用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy， SEM） 观察水凝胶的多孔网络结构。 3. 流变学性能： 使用旋转流变仪评估水凝胶的机械性能（储能模量G‘和损耗模量G“）、自愈合能力（通过交替应变扫描测试）和可注射性（剪切稀化行为）。 4. 粘附性能： 通过搭接剪切试验，定量测试水凝胶对猪皮的粘附强度，并评估其原位成形和贴合不规则创面的能力。
流程三：体外生物相容性与生物活性评估 * 生物相容性测试： * 细胞活力： 将小鼠成纤维细胞（L929）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与水凝胶共培养，使用钙黄绿素-AM（Calcein-AM）/碘化丙啶（Propidium Iodide， PI） 活死细胞染色和CCK-8法检测细胞存活率和增殖活性。 * 细胞形态： 通过细胞骨架染色（β-肌动蛋白染色）观察细胞在水凝胶上的铺展情况。 * 血液相容性： 进行体外溶血实验，评估水凝胶对红细胞的影响。 * 生物活性机制研究： * 巨噬细胞极化调控： 将小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）与水凝胶共培养，并用脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS） 诱导炎症。通过实时定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction， RT-qPCR）、免疫荧光（Immunofluorescence， IF）、蛋白质印迹法（Western Blot， WB） 和流式细胞术（Flow Cytometry） 检测M1型（促炎，标记物：iNOS， TNF-α， CD86）和M2型（抗炎，标记物：Arg-1， IL-10， CD206）巨噬细胞相关基因和蛋白的表达变化。 * 促血管生成作用： 对HUVECs进行体外成管实验，并通过IF和WB检测血管生成相关标志物（CD31， VEGFA）的表达。 * 促细胞迁移与纤维生成： 对L929细胞和HUVECs进行划痕愈合实验和Transwell迁移实验，评估细胞迁移能力。通过IF和WB检测成纤维细胞活化及胶原生成的关键标志物α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-Smooth Muscle Actin， α-SMA） 的表达。
流程四：体内糖尿病伤口愈合评估 * 动物模型建立与分组： 使用SD大鼠建立STZ诱导的1型糖尿病全层皮肤缺损模型。将40只大鼠随机分为4组：PBS对照组、柠檬外泌体组、GelMA/DAS水凝胶组和GelMA/DAS/Exo水凝胶治疗组。 * 伤口处理与观察： 在创面形成后，立即应用相应处理材料，并用薄膜和绷带覆盖。在术后第0、7、14天进行创面拍照，动态观察并计算伤口愈合率。 * 组织学与免疫组化分析： 术后第14天处死动物，取创面组织进行石蜡包埋和切片。进行苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin， H&E） 染色和Masson三色染色以评估组织再生、炎症浸润和胶原沉积情况。通过免疫组织化学（Immunohistochemistry， IHC） 染色，在组织水平检测巨噬细胞表型（Arg-1， iNOS）、血管新生（CD31， VEGFA）和胶原形成（α-SMA）的标志物表达。
流程五：止血性能评估 * 实验设计： 为了评估水凝胶作为敷料的即时止血能力，研究进行了两项体内止血实验：大鼠断尾止血实验和大鼠肝脏部分切除止血实验。 * 评价指标： 以医用明胶海绵为阳性对照，以未处理组为阴性对照，通过观察纱布染血量和称重法量化失血量，比较各组止血效果。
主要研究结果 结果一：机制探索结果。RNA-seq分析筛选出271个上调基因和20个下调基因。GO和KEGG富集分析显示，这些差异基因与TNF、NF-κB、IL-17等信号通路密切相关，这些通路在调控巨噬细胞M1/M2表型转换、炎症和免疫功能中起关键作用。这提示糖尿病皮肤损伤的微环境中存在巨噬细胞极化失衡和严重炎症。网络药理学分析确定了190个柠檬与DSI的共同作用靶点，PPI网络和KEGG通路分析进一步表明，柠檬的活性成分与炎症、氧化应激、细胞增殖和凋亡等过程相关，提示其具有通过多靶点调控糖尿病皮肤细胞通路的综合治疗潜力。非靶向代谢组学分析显示，柠檬外泌体富含D-核糖-植物鞘氨醇、柠檬酸等活性成分，且其维生素C和类黄酮含量与柠檬汁基本相似，但具有纳米囊泡结构的保护。
结果二：材料表征结果。成功提取出形态均一、具有膜结构的柠檬外泌体，粒径范围为85.0-515.0 nm，并能被目标细胞有效摄取。成功合成了GelMA/DAS/Exo水凝胶。SEM显示其具有均匀的多孔结构。流变学测试表明，UV固化后的水凝胶机械强度显著增强，具有优异的自愈合能力和剪切稀化特性（即可注射性）。搭接剪切试验证明，UV固化显著提高了水凝胶对猪皮组织的粘附强度（从~1.7 kPa提升至~24 kPa），并能紧密贴合不规则表面。这些特性为其作为创面敷料的应用奠定了基础。
结果三：体外生物活性结果。活死染色和CCK-8结果显示，GelMA/DAS/Exo水凝胶具有良好的细胞相容性，支持L929和HUVECs的粘附、铺展和生长，且无溶血现象。机制研究表明： 1. 巨噬细胞重编程： 与对照组和单纯水凝胶组相比，GelMA/DAS/Exo处理能显著降低RAW264.7细胞中M1型标志物（iNOS， TNF-α）的表达，同时提升M2型标志物（Arg-1， IL-10）的表达。在LPS诱导的炎症模型中，该水凝胶同样能促进巨噬细胞从促炎的M1型向抗炎的M2型极化，流式结果证实CD86+细胞比例下降而CD206+细胞比例上升。 2. 促血管生成： 成管实验显示，GelMA/DAS/Exo组能形成更多、更完整的管状结构。IF和WB证实，该处理能显著上调HUVECs中CD31和VEGFA的表达。 3. 促细胞迁移与纤维生成： 划痕实验和Transwell实验表明，柠檬外泌体能显著促进L929细胞和HUVECs的迁移。IF和WB显示，其能上调成纤维细胞中α-SMA的表达，促进胶原纤维生成。
结果四：体内伤口愈合结果。在糖尿病大鼠模型中，为期14天的观察显示，GelMA/DAS/Exo水凝胶治疗组的伤口愈合速度最快，愈合效果最好。组织学分析（H&E和Masson染色）表明，该治疗组炎症细胞浸润最少，新生上皮更完整，胶原沉积更丰富、排列更有序。免疫组化结果与体外实验一致：治疗组创面组织中M2型巨噬细胞标志物Arg-1表达上调，M1型标志物iNOS表达下调；血管标志物CD31和VEGFA以及胶原标志物α-SMA的表达均显著增强。这些结果在体内验证了该水凝胶通过免疫调节、促进血管新生和胶原合成来加速糖尿病伤口愈合的多重功效。
结果五：止血性能结果。在大鼠断尾和肝损伤模型中，GelMA/DAS/Exo水凝胶均表现出优于医用明胶海绵的止血效果，能更快止住出血并减少失血量，证明了其作为创伤敷料的即时止血潜力。
研究结论与价值 本研究成功开发并系统评估了一种负载柠檬来源外泌体的GelMA-DAS复合水凝胶敷料（GelMA/DAS/Exo hydrogel），用于治疗糖尿病皮肤损伤。主要结论如下： 1. 科学价值： 本研究首次将柠檬外泌体应用于糖尿病伤口愈合，并通过转录组学和网络药理学相结合的策略，深入阐释了糖尿病创面免疫微环境失衡的特征以及柠檬外泌体多靶点、多通路作用的潜在分子机制，为植物外泌体治疗慢性伤口提供了新的理论依据和研究范式。 2. 技术方法创新： 研究设计并制备了一种兼具良好生物相容性、可注射性、自愈合性、强组织粘附性以及缓释功能的新型智能水凝胶，有效解决了外泌体在创面局部递送中的稳定性、持续性和渗透性难题。 3. 应用价值： 该水凝胶敷料在糖尿病大鼠模型中展现出卓越的促愈合效果，其作用机制明确，即通过“重编程巨噬细胞极化（M1→M2）以减轻炎症”和“促进血管内皮细胞与成纤维细胞的增殖迁移以加速血管新生与组织再生”的双重途径协同发挥作用。此外，其还具备良好的止血性能。因此，GelMA/DAS/Exo水凝胶是一种具有重要临床转化潜力的糖尿病伤口修复候选材料。
研究亮点 1. 研究对象的创新性： 首次探索并证实了柠檬来源外泌体在促进糖尿病伤口愈合方面的显著疗效，为开发低成本、高产量、低免疫原性的植物源性治疗制剂开辟了新途径。 2. 研究策略的综合性： 采用了“生物信息学预测（转录组+网络药理学）→ 材料工程学构建（纳米外泌体+智能水凝胶）→ 体外机制验证（细胞分子水平）→ 体内功效评价（动物模型）”的完整研究链条，逻辑严谨，证据充分。 3. 材料设计的优越性： 所构建的GelMA/DAS/Exo水凝胶巧妙地整合了多种理想敷料的特性：UV触发固化便于原位贴合不规则创面；双网络（希夫碱键与光交联）赋予其优异的机械强度和自愈合能力；强组织粘附性确保敷料稳定；多孔结构利于营养物质交换和外泌体缓释。 4. 机制研究的系统性： 不仅证实了疗效，更从免疫调控（巨噬细胞表型转换）、血管再生和胶原合成等多个细胞层面阐明了其促进愈合的详细分子机制，形成了完整的证据体系。 5. 功能验证的全面性： 除了核心的促愈合功能外，还评估了材料的生物相容性、血液相容性和止血性能，为其安全有效的临床转化提供了全面的实验数据支持。