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FHIRM-TPM 2.0微型双光子显微镜在自由活动动物脑成像中的应用研究

作者及机构
本研究由北京大学分子医学研究所膜生物学国家重点实验室的Weijian Zong（宗伟健）和Runlong Wu（吴润龙）作为共同第一作者领衔，联合北京大学未来技术学院、基础医学院认知科学研究所、电子学系等14家单位合作完成，发表于《Nature Methods》2021年1月刊（DOI: 10.1038/s41592-020-01024-z）。

学术背景
本研究属于神经科学与生物医学工程交叉领域，旨在解决自由活动动物脑功能成像的技术瓶颈。传统微型显微镜受限于视野范围（FOV）、轴向分辨率和工作距离，难以实现三维神经元网络动态监测。团队前期开发的FHIRM-TPM 1.0虽具备单突触分辨率，但存在FOV小（150×150 μm²）、工作距离短（170 μm）和缺乏轴向扫描机制三大局限。为此，本研究提出升级版FHIRM-TPM 2.0系统，通过光学设计革新实现420×420×180 μm³的大视野三维成像，同时支持长期可拆卸式观测。

研究流程与方法
1. 光学系统重构
- 开发低倍率微型物镜（NA 0.5）与扫描透镜组合，将FOV扩大7.8倍至420×420 μm²，工作距离延伸至1 mm，并校正颅窗常用BK-7盖玻片的球面像差。
- 创新性设计轴向扫描模块（ZSM）：集成电调谐透镜（ETL）、中继透镜和微机电系统（MEMS）扫描器，形成4f共轭系统，使放大率不随焦距变化（补充材料图1d）。ETL可在1.5 ms内完成±30 m⁻¹屈光度调节，对应180 μm轴向扫描范围（图1c）。

1. 可拆卸式机械设计

   • 采用”基座-支架-头戴组件”三级结构（扩展数据图2）：基座永久固定于颅窗，头戴组件（含ZSM重4.2 g，不含则2.45 g）可反复拆装，通过精密定位系统实现亚微米级重复对准（扩展数据图9显示日间位移<35 μm）。
     

2. 性能验证实验

   • 分辨率测试：通过400 nm荧光珠成像验证横向分辨率1.13 μm，轴向12.18 μm（扩展数据图5c-g）。
     
   • 行为兼容性测试：搭载4.2 g头戴组件的小鼠在自由探索中运动距离（p=0.57）和速度（p=0.56）无统计学差异（扩展数据图3）。
     
   • 长期成像验证：对同一批MPFC神经元进行长达1个月的追踪，证明系统稳定性（扩展数据图8c-d）。
     

3. 神经科学应用

   • 三维网络解析：在额叶联合皮层（FRA）实现420×420×180 μm³体积内>350个神经元同步记录（图1d），首次实现树突（输入层）与胞体（输出层）的双平面关联分析（图1e-f）。
     
   • 社会行为研究：通过5天连续观测前额叶皮层（MPFC）的206（平面1）和269（平面2）个神经元，发现”社交开启”（on）与”社交关闭”（off）神经元群体的动态重组现象（图2d-e），仅19% on神经元和24% off神经元能维持两天以上的特性稳定性。
     

主要结果
1. 技术性能突破
- 大视野成像：单平面记录171±57.5个神经元（n=10只小鼠），较1.0版本提升8倍。
- 快速体积成像：通过ETL实现5 Hz的三维扫描速率（补充视频3）。
- 运动抗干扰：在电击恐惧实验中成功捕捉剧烈运动时的神经元活动（扩展数据图8a-b）。

1. 神经机制发现
   
   • 树突-胞体功能耦合：通过皮尔逊相关性分析（阈值>0.6）发现跨层神经元对倾向于垂直排列（平均偏心距120 μm，图2g），提示皮层柱状信息流的存在。
     
   • 社会神经元动态编码：MPFC中on/off神经元群体比例随社交经验变化，且存在显著层间差异（平面1 on神经元占比60% vs 平面2 40%，图2e）。
     

结论与价值
本研究通过FHIRM-TPM 2.0系统实现了三大突破：
1. 技术创新：首创可拆卸式双光子显微镜设计，结合ETL快速轴向扫描，为自由活动动物脑研究提供首个真正意义上的三维成像工具。
2. 科学发现：揭示MPFC社会神经元群体的时空动态编码规律，为理解高级认知功能的网络基础提供新证据。
3. 应用前景：该系统适用于学习记忆、神经再生、疾病进展等长期观测场景，其开源控制软件（GitHub: clarkewayne/fhirm-tpm-2.0-ginkgo-1.0.2）将推动微型显微镜技术标准化。

研究亮点
1. 跨尺度成像：在单突触（1 μm）与神经网络（420 μm）尺度间建立桥梁，首次实现自由活动动物皮层多层级活动同步解析。
2. 方法学创新：
- 4f共轭系统设计解决ETL应用中的像差问题（补充说明1）
- 基于NormCorre算法的运动校正框架（方法部分）
3. 行为范式结合：开发”两室社交测试”装置（图2a-b），实现自然行为与神经活动的精准关联分析。

该研究获国家自然科学基金（31327901等）和重点研发计划（2016YFA0500400）支持，相关技术已由北京超维景生物科技有限公司实现产业化。