本研究由中国科学院广州生物医药与健康研究院、再生医学省实验室、吉林大学药学院、暨南大学、南方医科大学南方医院、香港中文大学、香港创新科技院再生医学与健康中心等多个机构的科研人员共同完成。通讯作者为蔡景蕾与裴端卿。该研究论文于2021年3月16日在线发表于《Science China Life Sciences》期刊2021年12月第64卷第12期。

学术背景 人类胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）在治疗神经系统疾病方面具有巨大潜力，但其临床应用的关键前提是能够稳定、快速、高效地将其分化为所需的功能细胞类型。在众多分化路径中，首先将多能干细胞分化为神经祖细胞（NPCs）是一个限速步骤，此后的定向分化才能产生特定的神经元亚型。传统的神经分化方法，如拟胚体（EB）形成法和与基质细胞共培养法，存在耗时长（通常≥2周）、效率低、产物不纯等问题。近年来发展的单层分化法虽然有所改进，但仍需依赖多种信号通路（如SMAD信号通路）的抑制剂或细胞因子，且过程仍相对耗时，其详细机制也不甚清晰。因此，开发一种成分明确、操作简便、高效快速的神经祖细胞诱导方法，对于推动干细胞在神经疾病治疗中的应用至关重要。本研究旨在探索一种新的单层分化策略，利用明确的细胞外基质——I型胶原，在不添加外源性SMAD信号抑制剂或生长因子的条件下，实现从人多能干细胞到功能性神经祖细胞的高效诱导，并深入探究其背后的分子机制。

详细研究流程 本研究是一个系统的、多层次的实验流程，旨在验证新分化方法的有效性、评估所得NPCs的功能，并阐明其分子机制。主要流程可分为以下几个部分：

1. NPCs的诱导与基本表征 研究对象与样本量： 研究主要使用了两株细胞：人胚胎干细胞系H1和来自健康供者尿液细胞的重编程诱导多能干细胞系UC1。实验设置了多个重复组进行对比。 处理与实验： * 分化体系建立： 将hESCs/hiPSCs消化为单细胞，以一定密度接种于预先包被了I型胶原的培养板上。分化培养基为仅含N2补充剂的基础培养基（如RPMI 1640），分化过程中无需添加任何SMAD信号抑制剂（如Noggin、Dorsomorphin、SB431542）或细胞因子。作为对照，研究同时设置了在Matrigel（一种常用的、成分复杂的基底膜基质）上进行的单层分化，以及传统的EB分化法。 * 形态学观察： 每日观察细胞形态变化。在I型胶原上，细胞在第7天（D7）即可有效形成神经玫瑰花环样结构。 * 分子标志物检测： * 免疫荧光染色： 在分化过程中（如D0, D3, D5, D7）检测多能性标志物（OCT4, NANOG, SSEA4等）的消失，以及神经祖细胞标志物（SOX1, Nestin, PAX6）的表达和定位。 * 流式细胞术： 定量分析D7时神经玫瑰花环细胞中Nestin和PAX6的阳性率，评估分化纯度。 * 实时定量PCR： 动态监测分化过程中多能性基因和神经祖细胞基因的mRNA表达水平变化。 * 分化条件优化： 系统测试了不同基底（I型胶原、Poly-L-ornithine、空白对照）和不同基础培养基（RPMI1640, α-MEM, HG-DMEM, DMEM/F12）对神经分化的影响，确认I型胶原是高效分化的关键因素。

2. 诱导所得NPCs的功能验证 研究对象： 从hESCs/hiPSCs在I型胶原上诱导获得的NPCs（神经球）。 处理与实验： * 体外自发分化： 将NPCs球接种于Matrigel上，撤除生长因子EGF/bFGF，添加神经营养因子（BDNF, CNTF, GDNF, IGF-1等），进行2-3周的进一步分化。 * 免疫荧光染色： 检测分化产物中神经元标志物（βIII-tubulin/Tuj1, DCX, Synapsin）、星形胶质细胞标志物（GFAP）以及特定神经元亚型标志物（谷氨酸能Glu、GABA能GABA、多巴胺能TH）的表达。 * 电生理记录： 对分化出的神经元进行全细胞膜片钳记录，检测其电压门控Na⁺、K⁺电流、动作电位发放能力，以及对谷氨酸和GABA刺激产生的突触后电流，验证其电生理活性。 * 体内移植与功能评估： * 新生大鼠侧脑室移植： 将人源NPCs移植到新生SD大鼠的侧脑室中（n=10）。在移植后4周和12周，取脑组织进行切片分析。 * 免疫组化： 使用人源特异性胞质抗体STEM121追踪移植细胞，并共染Nestin、Tuj1、GFAP等标志物，评估NPCs在体内的存活、迁移（观察移植位点周围组织）及分化为神经元和星形胶质细胞的能力。 * 创伤性脑损伤（TBI）模型治疗： 建立SCID-beige小鼠TBI模型，一周后将hESC来源的NPCs移植到损伤区域周围（n=6），对照组注射培养基（n=6）。 * 行为学测试（圆柱体实验）： 在移植后4个月评估小鼠前肢使用不对称性的改善情况，以评估神经功能恢复。 * 组织学分析： 检测移植区域人源细胞（STEM121）的存活及其向神经元（NeuN, MAP2阳性）分化的能力。

3. 分化机制的探究 研究对象： 在I型胶原和Matrigel上分化的hESCs细胞样本（在不同时间点D1, D3, D5, D7收集）。 处理与实验： * SMAD信号通路分析： * qPCR与Western Blot： 比较两种基质上分化过程中TGF-β和BMP4的基因表达水平，以及其下游效应分子pSMAD1/5/8和pSMAD2/3的蛋白磷酸化水平。 * 功能验证： 在I型胶原分化体系中添加SMAD信号激活剂（BMP4, TGF-β），在Matrigel分化体系中添加SMAD信号抑制剂（Dorsomorphin, SB431542），观察对神经标志物（Nestin, PAX6）和上皮细胞标志物（CK18）表达的影响。 * 其他胶原类型测试： 测试了II、III、IV、V、VI型胶原对神经分化的支持效果，通过形态观察和PAX6阳性率评估。 * 整合素功能阻断实验： 在分化初期使用抗-β1整合素阻断抗体处理细胞，观察细胞贴壁、形态及神经标志物表达的变化。 * 多组学测序分析（核心机制探索）： * RNA测序（RNA-seq）： 对I型胶原组和Matrigel组在不同时间点的细胞进行转录组测序（两个生物学重复）。通过主成分分析（PCA）、差异表达基因分析、基因聚类分析和基因本体论（GO）分析，比较两组细胞在分化轨迹、基因表达模式及生物学过程上的差异。 * ATAC测序（ATAC-seq）： 对相同样本进行染色质可及性测序（两个生物学重复）。分析染色质开放/闭合的动态变化（如持续开放、持续闭合、瞬时开放、瞬时闭合等模式），比较两组细胞在表观遗传层面的差异。通过分析差异开放区域相关的转录因子结合基序，推断调控细胞命运的关键转录因子。

4. 数据分析流程 * 对于RNA-seq和ATAC-seq数据，使用标准流程进行比对（如Bowtie2比对到hg38基因组）、质量控制、peak calling（如使用Dfilter）和生成可视化文件（如bigWig）。 * 使用生物信息学工具（如DeepTools, glbase）进行PCA分析、差异peak/基因鉴定、GO富集分析、基因聚类和转录因子基序富集分析。 * 所有定量数据（如qPCR、流式结果）以均值±标准误表示，使用SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA）和t检验，P<0.05被认为具有统计学显著性。

主要研究结果 1. I型胶原可高效诱导产生高质量NPCs： 在仅含N2补充剂的简单培养基中，hESCs/hiPSCs在I型胶原上7天内即可形成神经玫瑰花环结构。分化过程中多能性标志物迅速下调，而神经祖细胞标志物（SOX1, Nestin, PAX6）从第3天开始上调，至第7天高度表达。流式结果显示超过90%的细胞表达Nestin，近80%表达PAX6，纯度显著高于EB法和传统单层法（在Matrigel上）。这些NPCs在体外可自发分化为具有电生理活性的多种神经元亚型（谷氨酸能、GABA能、多巴胺能）和星形胶质细胞。

2. 诱导的NPCs在体内具有治疗潜力： 移植实验证明，这些NPCs能在新生大鼠脑内存活至少12周，并迁移至移植位点周围，分化为神经元和星形胶质细胞。更重要的是，在TBI小鼠模型中，移植这些NPCs能显著改善小鼠的前肢运动功能缺陷，证明了其修复损伤的 therapeutic potential。

3. I型胶原与Matrigel诱导截然不同的细胞命运： 在相同培养基下，接种于Matrigel的细胞未形成神经玫瑰花环，而是向上皮样细胞分化。机制研究发现，Matrigel会强烈激活BMP4和TGF-β信号（表现为pSMAD1/5/8和pSMAD2/3水平升高），而上皮细胞标志物CK18表达上调。相反，在I型胶原上，SMAD信号在整个分化过程中均处于抑制状态。添加SMAD激活剂会抑制I型胶原上的神经分化，而添加SMAD抑制剂则能部分挽救Matrigel上的神经分化。这表明I型胶原的微环境天然地抑制了不利于神经分化的SMAD信号。

4. II、III型胶原也有类似效果，整合素β1可能非必需： 研究发现II型和III型胶原也能支持高效的神经分化，而IV、V、VI型胶原效果较差。虽然I型胶原主要通过整合素（如α2β1）与细胞结合，且β1整合素高表达，但使用抗-β1整合素阻断抗体后，细胞虽呈悬浮球形生长，仍能高表达Nestin和PAX6，提示整合素介导的粘附可能不是I型胶原促进神经分化的唯一或主要机制。

5. 多组学揭示独特的转录组和染色质动力学： RNA-seq分析显示，I型胶原组和Matrigel组的分化轨迹从早期（D3）就开始分离。在I型胶原上，多能性基因（如POU5F1/OCT4）迅速沉默，而神经发育早期标志物（如OTX2）从D3即开始上调，随后激活PAX6、Nestin等基因。GO分析表明，I型胶原组D5特异性表达的基因富集于神经元投射、轴突发生等神经发育过程，而Matrigel组则富集于上皮、内皮细胞分化相关过程。 ATAC-seq分析提供了更深入的机制见解：I型胶原介导了独特的染色质可及性动态变化。与Matrigel相比，I型胶原上大量与多能性相关的染色质区域特异性关闭（如FOXD3, POU5F1, TDGF1基因附近），同时大量与神经命运相关的区域特异性开放（如CDH2, PAX6, NRCAM基因附近）。在分化后期（D5，D7），I型胶原组特异性开放的染色质区域远多于Matrigel组。对这些区域进行转录因子基序富集分析发现，I型胶原组开放的位点富含神经命运相关转录因子（如SOX2/3, PAX6, LHX, AP1）的结合基序；而Matrigel组开放的位点则富含与中胚层/上皮命运相关的转录因子（如GATA3, TEAD3/4, ISL1, AP2）的基序。这从表观遗传层面解释了为何相同的培养基下，不同的基质会导向完全不同的细胞命运。

研究结论 本研究建立了一种新颖、高效且成分明确的单层分化方法，仅使用I型胶原作为基质和含N2补充剂的基础培养基，即可在一周内从人多能干细胞高效诱导出功能性的神经祖细胞。该方法无需添加外源性信号通路抑制剂或生长因子，简化了流程，提高了可重复性。诱导出的NPCs具有典型的分子标志物，在体外能分化为具有电生理活性的多种神经元和胶质细胞，在体内移植后能存活、整合并促进创伤性脑损伤后的功能恢复，展示了临床应用的潜力。 机制上，本研究首次系统阐明了I型胶原作为基质在神经定向分化中的关键作用：它通过创造一个独特的微环境，抑制了多能干细胞中SMAD信号的激活，从而避免了向上皮/中胚层命运的分化。更重要的是，通过整合转录组和表观基因组分析，研究揭示了I型胶原通过调控独特的染色质可及性动力学，快速关闭多能性基因座的同时开放神经特异性基因座，从而高效地将细胞命运推向神经谱系。这为理解细胞外基质如何通过影响表观遗传状态来指导干细胞命运决定提供了新的见解。

研究亮点 1. 方法学创新： 开发了一种极其简化的神经祖细胞诱导方案，仅需I型胶原和基础培养基，无需任何小分子抑制剂或生长因子，将诱导时间缩短至7天，且效率高、纯度高。 2. 机制深度挖掘： 不仅停留在表型验证，还深入到了信号通路（SMAD）和表观遗传调控（染色质可及性）层面，综合运用RNA-seq和ATAC-seq多组学手段，清晰地描绘了I型胶原如何通过调控全局染色质状态来驱动神经分化的分子路径。 3. 功能验证全面： 从体外分子表型、电生理特性，到体内移植存活、迁移、分化及动物模型行为学改善，提供了多层次、完整的证据链，证明了所得NPCs的功能完备性和治疗潜力。 4. 对照系统完善： 通过与广泛使用的Matrigel基质进行平行、系统的比较，突出了I型胶原的独特优势，并揭示了传统基质可能存在的局限性（如激活非神经分化信号）。 5. 提出新见解： 研究结果支持了一种细胞命运决定的“二元逻辑”，即细胞外基质通过协调特定转录因子结合位点的染色质开放与关闭，决定性地引导干细胞向特定谱系分化。

其他有价值内容 研究还简要探讨了ROCK抑制剂Y-27632在分化起始时对于细胞存活和贴壁的必要性，但明确指出其并非决定神经分化的关键因素，关键点在于基质的选择。此外，研究数据已公开，可供同行进一步分析和验证。这项工作为基于人多能干细胞的神经疾病细胞治疗提供了一个稳定、高效且易于标准化的NPC生产平台，具有重要的转化医学价值。