内皮细胞来源的PDGF-BB与HB-EGF协同调控血管生成性管状组装及稳定化过程中的周细胞募集

主要作者：Amber N. Stratman、Amy E. Schwindt、Kristine M. Malotte、George E. Davis
研究机构：密苏里大学哥伦比亚分校医学院， Dalton心血管研究中心，医学药理学与生理学系及病理学与解剖科学系
发表期刊：Blood
发表时间：2010年11月25日；2010年8月25日在线预发表
DOI：10.1182/blood-2010-05-286872

一、研究背景与目的

血管新生与管状组装是胚胎发育、组织修复及多种病理状态下的关键生物学过程。在微血管系统中，内皮细胞（endothelial cells, ECs）形成管腔结构后，需要周细胞（pericytes）的募集与覆盖来完成管壁成熟与稳定化。周细胞不仅为内皮管提供结构支撑，还参与基底膜基质（basement membrane matrix）的合成与沉积。基底膜成分包括IV型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及巢蛋白等，这些分子的沉积与血管管径的限制和血管稳定性的提高密切相关。此前该实验室已建立三维（3D）胶原基质中内皮细胞与周细胞共组装模型，并证明周细胞的募集能够刺激基底膜形成。然而，在此过程中，驱动周细胞定向迁移和增殖的具体内皮来源因子及其协调机制尚未被系统阐明。

血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）已被认为是内皮来源的周细胞有丝分裂原和趋化因子，内皮特异性敲除PDGF-BB的小鼠表现出周细胞显著减少。但即使缺失PDGF-BB，仍有约50%的周细胞保留在血管上，提示存在其他互补性因子。近年研究发现表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）家族成员，尤其是肝素结合性EGF样生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF），可能参与血管平滑肌细胞及周细胞的募集。本研究旨在利用无血清、仅含内皮细胞和周细胞两种细胞类型的三维胶原基质共培养体系，探讨内皮来源的PDGF-BB与HB-EGF是否协同调控周细胞的运动、增殖、募集以及随后的基底膜沉积和血管管径限制，并在鹌鹑胚胎体内模型中验证上述功能。

二、研究设计与主要方法

本研究采用体外三维胶原基质管状组装模型与体内鹌鹑胚胎发育模型相结合的策略，通过药理学阻断、受体陷阱、中和抗体以及siRNA介导的基因沉默等手段，系统评估PDGF-BB和HB-EGF在周细胞募集与血管成熟中的功能。

首先，作者建立了人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）与人脑血管周细胞（human brain vascular pericytes, HBVPs）的共培养体系。HUVECs以2 × 10⁶ cells/mL、HBVPs以0.4 × 10⁶ cells/mL混合，悬浮于2.5 mg/mL的I型胶原基质中，在添加40 ng/mL FGF-2和200 ng/mL干细胞因子、基质细胞衍生因子1α及白细胞介素-3的无血清条件下进行三维培养，培养时间为72–120小时。为了观察周细胞运动，HBVPs被标记为核定位绿色荧光蛋白（GFP）。通过时间推移显微成像技术，每隔10分钟采集图像，利用Metamorph软件追踪周细胞核的位移，计算平均速度、总移动距离及距起始点的平均距离，以评估周细胞在有无EC存在下的迁移模式。

为了判断哪些内皮来源因子介导周细胞募集，研究团队检测了ECs条件培养基中的PDGF-BB和HB-EGF表达，并对EC单培养、周细胞单培养以及两者的共培养进行受体磷酸化分析，检测PDGFRβ、EGFR和ErbB4的活化状态。接下来，使用可溶性受体陷阱PDGFRβ-Fc、EGFR-Fc、ErbB4-Fc以及作为对照的TrkB-Fc，以50 μg/mL的浓度单独或联合加入共培养体系，观察周细胞与内皮管的相关率、周细胞增殖数量及内皮管宽度。为验证受体在周细胞中的特异性作用，研究者设计了两条针对PDGFRβ、EGFR和ErbB4的siRNA序列，分别转染周细胞或内皮细胞，再评估周细胞募集与管径变化。

进一步，作者使用抗PDGF-BB和抗HB-EGF的中和抗体（各50 μg/mL）单独或联合处理共培养物，以明确配体的特异性贡献。与此同时，利用核GFP标记的周细胞进行实时追踪，分析阻断PDGF-BB与HB-EGF后周细胞的运动速率和方向性变化。为了评估基底膜沉积，作者在无去垢剂条件下进行免疫荧光染色，检测IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的细胞外沉积强度，并通过Metamorph软件进行荧光强度定量。

在体内实验中，作者选用鹌鹑胚胎模型。在胚胎发育72小时时，将化学抑制剂伊马替尼（imatinib，抑制PDGFRβ）和吉非替尼（gefitinib，抑制EGFR）以及抗PDGF-BB和抗HB-EGF中和抗体单独或联合注射入卵内。药物浓度为100 nM，抗体浓度为20 μg/mL。继续孵育至144小时，观察胚胎表型，并对绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）组织进行免疫染色。使用QH1抗体标记内皮细胞，PDGFRβ抗体标记周细胞，统计未与内皮管相关的周细胞数量。同时进行纤维连接蛋白的细胞外染色，定量分析基底膜沉积强度，并测量内皮管宽度和内皮分支点数量。

三、主要研究结果

在无ECs条件下，周细胞在三维胶原基质中呈现方向性缺失的随机或环形运动，平均速度及距起始点的距离均显著低于有ECs共培养条件。ECs的存在使周细胞增殖率提高约3倍，且这种促增殖作用主要发生在72小时前。免疫印迹结果显示，ECs在形态发生过程中大量产生PDGF-BB和HB-EGF。受体磷酸化分析显示，在EC-周细胞共培养体系中，PDGFRβ、EGFR和ErbB4的磷酸化水平显著升高，而单独的EC或周细胞培养中上述受体的活化程度很低。

加入可溶性受体陷阱后，单独阻断PDGFRβ、EGFR或ErbB4均导致周细胞与内皮管相关率从对照组的约85%下降至约60%；当PDGFRβ-Fc与EGFR-Fc或PDGFRβ-Fc与ErbB4-Fc联合使用时，相关率进一步降至35%–40%。同时，内皮管宽度显着增加，周细胞总数减少约30%–40%。siRNA实验显示，在周细胞中沉默PDGFRβ、EGFR或ErbB4均可抑制周细胞募集并增加管宽；而在ECs中沉默相同受体则无此效应，证实这些受体在周细胞上发挥关键作用。

中和抗体实验结果与受体陷阱一致。单独使用抗PDGF-BB或抗HB-EGF抗体使周细胞相关率降低20%–30%；两者联合阻断时，约80%的周细胞处于未相关状态。相应地，内皮管宽度显着增大，周细胞总数减少。实时追踪分析显示，联合阻断PDGF-BB和HB-EGF后，周细胞的平均速度、总移动距离以及距起始点的平均距离均显着下降，表明周细胞失去了持续定向迁移的能力。这一结果在0–72小时和72–120小时两个时间窗内均得到验证，说明PDGF-BB与HB-EGF不仅调控周细胞向新生内皮管的初始募集，也参与周细胞沿内皮管外表面的后续迁移。

基底膜沉积分析显示，在PDGFRβ-Fc与EGFR-Fc联合阻断周细胞募集的共培养体系中，IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的细胞外沉积强度显着降低。免疫荧光强度图谱显示，基底膜蛋白主要定位于有周细胞覆盖的内皮管表面，而在周细胞募集受阻区域，基底膜蛋白几乎缺如。提示周细胞与内皮细胞的直接接触是基底膜组装的前提条件。

体内实验显示，联合注射伊马替尼与吉非替尼或联合注射抗PDGF-BB与抗HB-EGF抗体，均可引起胚胎颅部和腹部血管出血表型，提示血管稳定性受到破坏。CAM组织的免疫染色分析显示，在对照组约15%–20%的周细胞与内皮管无相关，而在双阻断组该比例显着上升，达到50%–60%。纤维连接蛋白的细胞外沉积强度在双阻断组显着降低。此外，双阻断组CAM血管内皮管宽度增加，内皮分支点数量减少，提示血管重塑受阻。特别值得注意的是，在吉非替尼与伊马替尼联合处理组中，内皮管呈现“膜皱褶样”表型，这可能反映了因周细胞缺失和基底膜不完整而导致的内皮持续激活状态。

四、研究结论与意义

本研究首次证明，在无血清、仅包含ECs和周细胞的三维胶原基质共培养体系中，ECs是周细胞获得持续性定向运动和增殖能力所必需的。EC来源的PDGF-BB和HB-EGF通过分别激活周细胞上的PDGFRβ以及EGFR/ErbB4，协同驱动周细胞向新生内皮管募集，并介导周细胞沿内皮管外表面的迁移。两种因子的联合阻断可几乎完全抑制周细胞募集，导致基底膜沉积显着减少、内皮管宽度增大。体内鹌鹑胚胎实验进一步证实，同时干扰PDGFRβ和EGFR信号通路会引发与抗PDGF-BB和抗HB-EGF抗体处理相同的表型，包括周细胞相关率降低、纤维连接蛋白沉积减少、血管管径增大、分支减少以及血管出血。

本研究的重要性在于：第一，它明确揭示了在血管发育过程中，PDGF-BB与HB-EGF作为内皮来源的双重信号，不仅在功能上互补，而且在周细胞募集的效率上具有协同效应。这解释了为何PDGF-BB缺失后仍有部分周细胞覆盖血管。第二，本研究将周细胞的定向迁移、增殖和基底膜组装有机联系起来，强调了物理性周细胞-内皮细胞接触对基底膜沉积的必要性。第三，体内外模型的高度一致性证明了该三维共培养系统在解析血管成熟机制中的价值，并为后续研究其他调控因子及信号通路提供了可靠平台。

在疾病方面，糖尿病视网膜病变、氧诱导性视网膜病变和肿瘤血管异常等疾病均伴随周细胞覆盖减少和基底膜不完整。本研究发现提示，PDGF-BB和HB-EGF信号的失衡可能是导致微血管功能障碍的重要机制之一。恢复或增强这两种因子的协同作用可能成为改善周细胞覆盖、促进血管稳定化的治疗策略。此外，该模型系统可用于筛选影响EC-周细胞相互作用的药物或环境因素，有助于深入理解肿瘤血管异常和微血管病变的发病机制。

五、研究亮点

本研究的核心亮点包括：第一，在无血清、仅含两种细胞的三维模型中，明确证明ECs释放的PDGF-BB和HB-EGF是驱动周细胞募集和管状成熟所必需且充分的关键因子。第二，利用组合阻断策略，揭示了两种因子的协同而非冗余功能。第三，通过siRNA分别敲低ECs或周细胞中的受体，确认这些受体在周细胞上的特异性作用。第四，体外结果在鹌鹑胚胎体内模型中得到验证，证实了PDGF-BB/HB-EGF轴在发育性血管稳定化中的生理功能。第五，首次将周细胞的定向迁移能力与基底膜组装和血管管径限制联系起来，提供了从细胞运动到组织形态发生的完整逻辑链条。