本文属于类型a，是一篇原创研究论文。
一、研究作者、机构与发表信息
该研究由Shruthi Kalgudde Gopal、Ruoxuan Dai、Ania Maria Stefanska、Meshal Ansari、Jiakuan Zhao、Pushkar Ramesh、Johannes W. Bagnoli、Donovan Correa-Gallegos、Yue Lin、Simon Christ、Ilias Angelidis、Valerio Lupperger、Carsten Marr、Lindsay C. Davies、Wolfgang Enard、Hans-Günther Machens、Herbert B. Schiller、Dongsheng Jiang和Yuval Rinkevich等人共同完成。第一作者为Shruthi Kalgudde Gopal和Ruoxuan Dai，通讯作者为Herbert B. Schiller、Dongsheng Jiang和Yuval Rinkevich。研究机构主要包括德国亥姆霍兹慕尼黑中心再生生物学与医学研究所、肺健康与免疫研究所、人工智能健康研究所、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学、卡罗林斯卡学院以及慕尼黑工业大学。论文发表于《Nature Communications》期刊，2023年5月发表，DOI为10.1038/s41467-023-38591-6。
二、研究背景与目的
本研究属于再生医学与基质细胞生物学领域，聚焦于皮肤损伤修复过程中成熟脂肪细胞与成纤维细胞之间的谱系关系。长期以来，伤口愈合与瘢痕形成中肌成纤维细胞的来源并不完全清楚，主流假说认为脂肪细胞在损伤后可能转化为肌成纤维细胞，参与瘢痕形成。这种“谱系可塑性”观点在糖尿病、纤维化疾病和皮肤瘢痕等临床问题中具有重要意义。然而，以往支持脂肪细胞向成纤维细胞转化的证据多基于少数标志物表达或形态学变化，缺乏严格的谱系追踪和功能验证。因此，本研究旨在利用遗传谱系示踪、活体成像、单细胞转录组学和移植实验等多种手段，直接检验皮肤损伤后成熟脂肪细胞是否会去分化、转分化或与成纤维细胞融合，从而转变为促纤维化的肌成纤维细胞。
三、研究流程与实验方法
本研究包括多个相互衔接的实验程序。首先，研究者使用两种转基因小鼠品系进行谱系示踪：AdipoqCre;R26mTmG小鼠用于标记成熟脂肪细胞（绿色荧光蛋白GFP），En1Cre;R26mTmG小鼠用于标记engrailed-1谱系阳性的成纤维细胞（EPFs），后者被认为是背部皮肤瘢痕形成的主要细胞来源。从新生小鼠背部皮肤制备全皮层皮肤外植体，在体外培养1至4天以模拟损伤和瘢痕形成过程，然后通过荧光激活细胞分选（FACS）富集GFP阳性细胞，进行单细胞RNA测序（mcSCRB-seq）。该流程中使用了分子拥挤单细胞RNA条形码与测序技术，并在96孔板中直接分选单细胞，以提高低丰度脂肪细胞的捕获效率。数据分析采用Scanpy和Diffxpy等工具进行无监督聚类、差异表达分析和扩散图构建，并通过Pearson相关分析评估不同细胞状态之间的转录组相似性。
第二项程序是活体成像与细胞行为追踪。研究者将AdipoqCre或En1Cre小鼠与R26LSL-H2B-mCherry核报告小鼠杂交，使脂肪细胞或成纤维细胞的细胞核表达mCherry。利用多光子显微镜对体外培养的外植体进行三维延时成像，持续时间可达15小时，时间间隔15分钟。为了维持成像过程中的生理条件，研究者改造了培养系统，加入硅胶环以允许显微镜物镜接近样本，同时保持温度、湿度和CO2浓度。细胞追踪分为手动追踪和Imaris软件自动追踪两种方式，定量分析细胞迁移速度、方向性、运动相似性和集体性。
第三项程序是细胞融合排除实验。利用R26mTmG双荧光报告系统，检测脂肪细胞和成纤维细胞中是否存在GFP与tdTomato共定位的黄色荧光，以判断是否发生异型细胞融合。
第四项程序是细胞外基质（ECM）沉积功能实验。研究者从外植体中分选脂肪细胞和成纤维细胞，在体外培养并给予重组TGFβ1刺激72小时，随后进行去细胞化处理，通过免疫荧光染色检测I型胶原和纤连蛋白的沉积量。
第五项程序是体内伤口模型与移植实验。在成年AdipoqCre;R26mTmG和En1Cre;R26mTmG小鼠背部制备全层切除伤口，于第7、10和21天取材。对第10和21天的伤口进行FACS分选GFP阳性细胞，进行bulk RNA测序（MARS-seq），分析脂肪细胞和成纤维细胞在伤口愈合不同阶段的转录组差异。同时，将分选出的脂肪细胞或成纤维细胞与Matrigel混合，移植到免疫缺陷Rag2-/-小鼠的全层伤口中，7天后检测移植区域的ECM沉积，以评估两类细胞在体内形成瘢痕组织的能力。此外，通过免疫荧光染色检测伤口组织中αSMA、vimentin、Ki67、perilipin和cathelicidin相关抗菌肽（CRAMP）等标志物的表达。
四、主要研究结果
单细胞转录组分析显示，皮肤外植体中脂肪细胞和成纤维细胞的转录组在UMAP投影中大部分分离，尽管存在部分重叠。聚类分析鉴定出脂肪细胞和成纤维细胞各6个亚群，共12个细胞状态。Pearson相关分析表明所有12个亚群均未发生谱系交叉或汇聚。研究者鉴定出88个脂肪细胞核心基因和198个成纤维细胞核心基因，这些基因在培养过程中持续保持谱系特异性。基因本体富集分析显示脂肪细胞核心基因富集于“脂肪细胞分化”和“脂质代谢”等通路，而成纤维细胞核心基因富集于细胞外基质相关通路。值得注意的是，脂肪细胞亚群A1表现出迁移表型特征，表达Wipf1、Trim44、Optc等细胞骨架重塑相关基因，但仍保留Cfd和Cidec等脂肪细胞标志物。成纤维细胞亚群F2则高表达Col1a1、Col3a1、Fn1等促纤维化基因。
活体成像结果显示，损伤后脂肪细胞发生显著的形态学变化：从最初的圆形细胞逐渐出现丝状伪足，转变为椭圆形、纺锤形或成纤维细胞样形态。定量分析表明，培养第2天时36%的脂肪细胞具有丝状伪足，圆形脂肪细胞比例从第0天到第2天逐渐下降，而椭圆形和伸长形细胞比例增加。第3至5天，这些细胞又恢复为圆形形态。脂肪细胞在第2天至第3天表现出迁移行为，单个细胞可移动380微米。在体内伤口模型中，第7天伤口周围的脂肪细胞也出现成纤维细胞样伸长形态，第21天仍保持该形态。然而，免疫染色显示所有形态的脂肪细胞，包括迁移状态的细胞，均保留perilipin 1表达。
细胞融合实验未发现GFP和tdTomato共定位的细胞，排除了异型细胞融合的可能性。细胞迁移行为分析显示，脂肪细胞和成纤维细胞表现出截然不同的运动模式：培养第1天，53%的脂肪细胞从原始位置移开，但仅20%向瘢痕区域定向移动；而成纤维细胞中70%向瘢痕区域移动。第4天，成纤维细胞呈现高度集体性和协调性的迁移，而脂肪细胞迁移呈随机性和个体性。脂肪细胞的迁移速度变异较大，成纤维细胞则保持相对稳定的速度。
功能实验表明，无论是否经过TGFβ1刺激，脂肪细胞沉积的纤连蛋白和I型胶原均极低，而成纤维细胞在TGFβ1刺激后ECM沉积显著增加。体内伤口bulk RNA测序显示，第10天和第21天伤口中的脂肪细胞转录组与健康皮肤脂肪细胞聚集在一起，明显区别于成纤维细胞。免疫染色显示，迁移的脂肪细胞不表达αSMA、vimentin或Ki67，但在第7天伤口中约60%的迁移脂肪细胞表达CRAMP抗菌肽，第21天该表达明显降低。移植实验进一步证实，移植的成纤维细胞在伤口中形成异位瘢痕ECM结构，而移植的脂肪细胞几乎不产生ECM。
五、研究结论与意义
本研究明确指出，皮肤损伤后成熟脂肪细胞不会转化为肌成纤维细胞，也不会去分化或与成纤维细胞融合。脂肪细胞在损伤后经历可逆的形态学改变和迁移行为，但始终保持脂肪细胞谱系身份，并发挥抗菌、免疫调节等不同于成纤维细胞的生理功能。这一结论对再生医学中脂肪移植和皮肤替代物的设计具有直接指导意义：移植脂肪细胞不能直接贡献于修复组织的基质形成，但其可能通过分泌抗菌肽和免疫调节因子促进伤口愈合。此外，该研究澄清了脂肪细胞可塑性的争议，为理解基质细胞在组织稳态和修复中的谱系限制提供了重要证据。
六、研究亮点
本研究的亮点在于综合运用了多种互补技术来严格检验细胞可塑性假说，包括谱系示踪、单细胞转录组学、活体三维成像、细胞移植和功能实验。其中，将外植体培养与多光子显微镜相结合的长时间活体成像方法具有创新性，能够以前所未有的细节观察脂肪细胞和成纤维细胞在损伤后的动态行为。此外，该研究克服了以往脂肪细胞转录组分析中细胞数量过低的局限性，通过FACS富集和bulk RNA测序获得了200至2000个伤口脂肪细胞的数据，显著提高了分析的可靠性。更重要的是，该研究首次系统性地证明脂肪细胞在损伤后表现出独特的迁移模式（随机、个体性）和抗菌功能，为重新认识脂肪细胞在伤口愈合中的角色提供了全新视角。