文献简介

本文为一篇原创研究文章，题为“Optimization and Evaluation of Novel Antifungal Agents for the Treatment of Fungal Infection”，主要作者包括 Ji Won Choi、Kyung-Tae Lee、Siwon Kim 等，隶属于多个研究机构。文章发表在 Journal of Medicinal Chemistry 上，具体发表时间为 2021 年 10 月 18 日。

背景与研究目的

科学背景
真菌感染（fungal infections）对人类健康、动物和植物生态系统构成了严峻威胁，导致农业、工业及公共健康领域的高昂经济成本。流行病学数据显示，全球约有四分之一人口受真菌感染困扰，每年约有150万至200万人死于侵袭性真菌感染。机会性致病真菌（opportunistic infectious fungi），如 Cryptococcus、Candida 和 Aspergillus 属，是造成最严重真菌疾病的主要病原体。这些感染对患有 HIV/AIDS、癌症、糖尿病、呼吸疾病及接受手术或移植的病人具有较高威胁。

尽管真菌感染的临床重要性显著，目前的抗真菌药物种类有限，仅有四大类药物得到临床应用：
1. 多烯类（polyenes）如 Amphotericin B 和 Nystatin，通过破坏真菌膜的完整性发挥作用；
2. 唑类（azoles）和烯丙胺类（allylamines），如 Fluconazole 和 Terbinafine，抑制麦角甾醇生物合成酶；
3. 棘白霉素类（echinocandins），如 Caspofungin，影响真菌细胞壁完整性；
4. 嘧啶类类似物，如 5-Fluorocytosine，干扰 DNA 和 RNA 合成。

然而，这些抗真菌药物存在毒性、抗药性高、窄谱性、低生物利用度等限制，因此，开发更有效的抗真菌药物成为一个迫切需求。

研究目的
本文通过筛选自主药物库，试图发现并优化具有抗真菌活性的潜在化合物，最终评估其体外、体内的抗真菌效果及药物特性，并探索其作为抗真菌药物开发的潜力。

研究流程与实验设计

（一）筛选与化合物优化：引出基础活性化合物

研究首先在自主药物库中筛选能够对 Cryptococcus neoformans 产生抗真菌活性的化合物。通过最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）测试，选出了两个基础命中化合物（hit compounds），其 MIC 值分别为 32 和 16 μg/ml。为了改善其抗真菌活性和药物相似性，研究通过对命中化合物的芳基环、烷基链、甲基基团等部分进行多种取代（substitutions），系统优化其结构。

（二）合成优化化合物

优化化合物（如22h）的制备由多个化学合成步骤完成，涉及硼酸偶联反应（Suzuki coupling reaction），N-Boc氨基酸衍生化，氨基甲酸盐化，以及使用甲磺酸盐形成目标化合物。研究细致地设计了合成路线图及实验方法，确保每一步的反应条件和产率达到最佳。

（三）体外抗真菌活性测试

优化后的化合物被测试了对多种真菌病原体的抑菌活性，包括 Cryptococcus neoformans、Candida albicans、Candida glabrata 和 Aspergillus fumigatus。测试采用 CLSI 标准方法，对每种化合物的 MIC 值进行了全面评估。

（四）联合抗真菌治疗和抗药性评估

研究进一步评估了优化后化合物的联合抗真菌能力，与现有抗真菌药物（如 Amphotericin B、Fluconazole 等）配伍进行棋盘式实验（checkerboard assay），计算分数抑菌浓度（FIC）以判断协同性。此外，研究还监测了长期药物处理后可能引发的潜在抗真菌药物耐药性。

（五）机制研究与信号通路分析

为了明确22h的作用机制，研究利用超微结构分析技术（如透射电子显微镜）观察真菌细胞形态的变化。此外，研究通过 MPK1 MAPK 通路、不折叠蛋白反应（UPR）通路及钙调神经磷酸酶通路的激活水平，探讨22h对真菌细胞壁完整性的影响。

（六）体内及外用模型测试

研究最后评估了优化化合物在小鼠皮下感染模型及 ex vivo 人类指甲感染模型中的治疗效果。22h 被制备为外用制剂，分析其抑菌能力及对组织的生物安全性。同时，评估了重复用药后的体内毒性及药代动力学特性。

实验结果与关键发现

（一）性能最优化合物——22h

通过对结构优化，化合物 22h 被确定为最佳候选者，其对多种真菌病原体展现出广谱、高效的抗真菌活性。在 MIC 测试中，22h 对 Cryptococcus neoformans 的 MIC 值为 1 μg/ml，对 Candida albicans 和 Candida glabrata 的 MIC 值分别为 2 和 4 μg/ml。

（二）快速杀菌活性与协同效应

22h 在多种病原真菌中展现出快速的杀菌活性，例如在除菌实验中，22h 对 Cryptococcus neoformans 在 2 小时内几乎完全抑制菌群生长。与 Amphotericin B 联合使用，展现显著的药效协同作用（synergistic effects）。

（三）无抗药性发展风险

相比于已知抗真菌药（如 Fluconazole 和 Efinaconazole）引发的耐药性，长期使用22h未诱导任何耐药性真菌株的出现。

（四）细胞壁破坏为主要作用机制

22h 的抗真菌机制与破坏真菌细胞壁的完整性直接相关。细胞壁超微结构和厚度显著受损，同时 MPK1 、UPR 信号和钙调神经磷酸酶通路被显著激活。

（五）In Vivo 和 Ex Vivo 模型的治疗潜力

在小鼠皮下感染模型中，与 Fluconazole 相比，22h 显著减少了感染区域的炎症范围。在人体指甲感染实验中（由 Trichophyton rubrum 引起），22h 的抑菌效果优于临床外用药（如 Ciclopirox）。

结论与意义

本文通过对自主药物库的筛选和优化，发现并评估了高效候选化合物22h。研究表明22h具有广谱快速的杀菌特性，不容易发展耐药性，对现有抗真菌药表现出协同作用，且在体内外感染模型中的效果显著。同时，其作用机制涉及对真菌细胞壁的破坏，这为真菌细胞壁相关分子靶点的药物开发提供了重要参考。

科学和应用价值：
1. 22h 可能成为治疗系统性真菌感染的新一代抗真菌药物；
2. 外用制剂的开发优势，使其适合治疗皮肤、指甲病变等表皮感染；
3. 通过明确其作用机制，研究为抗真菌药物的设计和开发提供了重要靶点依据。

研究亮点

1. 发现并优化出一个全新的化学骨架，展现广泛的抗真菌活性；
2. 具有低毒性、高快速杀菌效果，以及与现有药物的协同抗真菌潜力；
3. 基于独特的细胞壁破坏机制，打开药物筛选的新视角。

上述文献为抗真菌药物开发领域提供了重要的新线索和方向，为抗真菌治疗面临的挑战提出了重要的解决方案。