在韩国嘉泉大学医学院分子医学系In-Sun Hong、Yunjae Jung等学者领导的团队，于2025年在《Advanced Science》期刊上发表了一项关于生殖毒理学检测平台构建的原创性研究。本研究旨在开发一种能够精确模拟人类卵巢-子宫内膜相互作用及月经周期动态变化，并能实时、灵敏预测生殖毒性的生物标志物集成类器官芯片（Organ-on-a-Chip, OOC）系统。
学术背景与动机： 药物开发与环境安全评价中，可靠预测生殖毒性仍是一个关键挑战。传统方法依赖二维单层细胞培养，难以重现女性生殖系统固有的三维多细胞结构、内分泌信号传导以及卵巢与子宫内膜间动态双向互作。现有单器官类器官芯片模型在模拟生殖轴生理复杂性方面存在局限：无法充分复制细胞外基质（ECM）富集的三维微结构，缺乏多器官间的双向内分泌反馈环路，且未能模拟月经周期中卵巢滤泡成熟与子宫内膜周期性变化的时序动态。为解决上述问题，本研究目标是构建一个集成了荧光报告基因的生物标志物驱动型卵巢-子宫内膜类器官芯片平台，该平台能同时复现体内生理结构和功能，并实现对毒性应激的早期、细胞类型特异性可视化监测。
研究详细流程： 本研究的核心流程包含四个主要阶段：芯片平台的仿生设计与制造、三维细胞微环境的构建与功能验证、生殖毒性生物标志物的发现与功能确证，以及集成荧光报告系统的构建与应用评估。
第一阶段是仿生卵巢-子宫内膜类器官芯片平台的制造与表征。 研究团队利用高分辨率3D打印技术制造模具，并用聚二甲基硅氧烷（PDMS）成型，制作出具有多腔室结构的弹性芯片。芯片核心设计包括：（1）卵巢与子宫内膜分区：卵巢室进一步划分为初级、窦状和排卵前卵泡三个特定区域，以模拟不同发育阶段；子宫内膜室则设计了模拟卵泡期和黄体期的区域。（2）多细胞类型共培养：在卵巢室中，引入了从接受体外受精（IVF）的患者中分离的原代人卵泡膜细胞和颗粒细胞，以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。子宫内膜室则包含五种细胞类型：从子宫肌瘤患者正常子宫内膜组织中分离的子宫内膜干细胞（Endometrial Stem Cells）、作为基质细胞功能替代的人真皮成纤维细胞、人巨噬细胞、人子宫肌层平滑肌细胞以及血管内皮细胞。（3）三维ECM微环境构建：所有细胞均被封装在由天然聚合物（胶原蛋白和透明质酸）与生物相容性交联剂（纤维蛋白原和凝血酶）组成的复合水凝胶中，以模拟体内ECM的机械和生化特性。 为了评估该3D组织结构的物理特性，研究团队进行了扫描电镜（SEM）观察、单轴压缩应力测试、溶胀性测试和流变学分析。结果显示，该复合水凝胶支架具有约40 kPa的平均抗压应力，在生理条件下溶胀变形最小，并且表现出剪切稀化特性（粘度随剪切速率增加从~1000 Pa·s降至接近零），证明其具备支持细胞长期培养的机械稳定性和合适的粘弹性。
第二阶段是评估封装在芯片内3D微环境中各类细胞的长期活性、表型维持与功能特性。 研究人员首先通过核染色确认了细胞在3D水凝胶基质中的均匀分布。随后，通过长达28天的活死染色和CCK-8代谢活性检测，证明尽管细胞活性和代谢功能随时间略有下降，但封装在芯片内的卵巢细胞（卵泡膜细胞、颗粒细胞、内皮细胞）和子宫内膜细胞（干细胞、基质细胞、巨噬细胞、肌层细胞）在第28天时均保持了超过70%的存活率和代谢活性，表明该天然聚合物3D微环境具有良好的细胞相容性。 更重要的是，免疫荧光染色分析证实，在芯片3D微环境中培养的各类细胞均能维持其细胞类型特异性表型标记物表达。卵泡膜细胞高表达促卵泡激素受体（FSHR）、促黄体生成素受体（LHR）、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）；颗粒细胞高表达FSHR、ER和PR；内皮细胞表达血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）和血管性血友病因子（vWF）；子宫内膜基质细胞表达波形蛋白（Vimentin）；巨噬细胞表达CD11b和CD68；子宫肌层细胞表达MyoD和Myogenin；子宫内膜干细胞则表达ER、PR和前列腺素E2（PGE2）受体。 功能验证实验进一步显示，封装在芯片中的卵巢细胞保持了类固醇生成能力，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测到它们分泌生理水平的孕酮和雌激素。当用子宫内膜来源的激素PGE2刺激时，卵巢细胞的代谢活性显著增强。同样，子宫内膜细胞也保持了功能性，ELISA检测到其分泌PGE2，并且在给予外源性雌激素刺激后，细胞存活率和代谢活性均显著提高。这些结果综合表明，该芯片平台成功构建了一个生理相关的3D微环境，能够支持多种卵巢和子宫内膜细胞长期维持其分子表型和关键生理功能。
第三阶段是识别和验证用于预测女性生殖毒性的可靠生物标志物。 研究选用国际公认的参考毒物二噁英（Dioxin）处理卵巢卵泡膜细胞、颗粒细胞以及子宫内膜干细胞，通过剂量反应研究确定了各细胞系的毒性暴露浓度范围。接着，对经不同浓度二噁英处理的这三种细胞进行了批量RNA测序（RNA-seq），以鉴定发生剂量依赖性转录变化的基因。转录组学分析揭示了一组与细胞应激反应和毒性相关通路相关的差异表达基因。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，进一步聚焦于与应激反应、解毒和损伤修复相关的信号通路。分析结果明确显示，在卵泡膜细胞和颗粒细胞中，血管生成素样蛋白4（Angiopoietin-like 4， ANGPTL4）是毒性暴露后最显著上调的基因；而在子宫内膜干细胞中，丝氨酸蛋白酶抑制剂B2（Serpin Family B Member 2， SERPINB2）是主要被诱导的基因。 为了验证测序结果，研究人员通过定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分析证实，在两种卵巢细胞中，ANGPTL4 的mRNA和蛋白表达水平均呈剂量依赖性上调；在子宫内膜干细胞中，SERPINB2 的表达也呈现剂量依赖性升高。此外，通过查询基因表达综合数据库（GEO）的公共转录组数据集，发现 ANGPTL4 和 SERPINB2 在多种毒性相关实验模型中均存在一致性上调，支持了它们作为细胞类型特异性毒性生物标志物的可靠性。 为了探究这些生物标志物是毒性暴露的被动指示物还是毒性损伤的功能性介导因子，研究团队进行了靶向基因敲低实验。利用短发夹RNA（shRNA）分别沉默卵泡膜细胞和颗粒细胞中的 ANGPTL4，以及子宫内膜干细胞中的 SERPINB2，随后再用二噁英处理。结果表明，基因敲低显著减轻了毒物诱导的多项有害效应，包括细胞活力下降、迁移能力受损、基质金属蛋白酶（MMP-2/MMP-9）表达升高、细胞凋亡增加以及caspase-3激活等。这证明 ANGPTL4 和 SERPINB2 不仅是生物标志物，更是细胞类型依赖性的毒性损伤关键调节因子。
第四阶段是开发基于生物标志物的荧光报告系统，并将其集成到类器官芯片中用于实时毒性预测。 研究人员构建了转录生物传感系统：将 ANGPTL4 的启动子区域分别与红色荧光蛋白mCherry（用于卵泡膜细胞）和绿色荧光蛋白GFP（用于颗粒细胞）融合；将 SERPINB2 的启动子与GFP（用于子宫内膜干细胞）融合。这些工程化构建体被稳定导入相应的靶细胞系。随后，这些携带荧光报告基因的细胞被接种到类器官芯片的相应腔室中。 当芯片暴露于参考毒物二噁英时，在卵巢室的所有卵泡亚区（初级、窦状、排卵前）均观察到强烈的荧光报告信号：携带 ANGPTL4-mCherry的卵泡膜细胞发出红色荧光，携带 ANGPTL4-GFP的颗粒细胞发出绿色荧光。同时，在子宫内膜室中，携带 SERPINB2-GFP的子宫内膜干细胞也显示出显著的绿色荧光。这表明毒性暴露特异性地激活了相应生物标志物的启动子。该平台的通用性通过暴露于多种结构机制不同的生殖/遗传毒物（如马兜铃酸、联苯胺、苯并[a]芘、司莫司汀）得到进一步验证，这些毒物均能引发卵巢和子宫内膜腔室中相应荧光报告基因的显著激活。
主要研究结果： 1. 成功构建了仿生多腔室卵巢-子宫内膜类器官芯片平台，该平台具有精确的3D空间结构、多种原代人类细胞类型以及模拟月经周期阶段变化的能力。 2. 所建立的胶原-透明质酸复合水凝胶3D微环境具有良好的机械性能和生物相容性，能支持卵巢和子宫内膜各类细胞长期（28天）维持高存活率、特异性表型和关键生理功能（如激素分泌和响应）。 3. 通过转录组学分析，发现并验证了细胞类型特异性的早期生殖毒性生物标志物：ANGPTL4 是卵巢（卵泡膜细胞和颗粒细胞）的毒性反应基因，SERPINB2 是子宫内膜（干细胞）的毒性反应基因。功能实验证实它们在介导毒性损伤中扮演主动角色。 4. **开发并集成了基于 ANGPTL4 和 SERPINB2 启动子的荧光报告系统**，实现了在类器官芯片平台上对多种生殖毒物暴露的实时、可视、定量和细胞区域特异性的早期检测，其响应早于传统的细胞毒性检测方法。
结论与价值： 本研究展示了一个新一代的、生物标志物驱动的生殖类器官芯片平台。它将多谱系人类原代细胞、ECM仿生3D微环境、周期性生殖信号以及荧光生物传感报告系统独特地结合在一起，能够提供实时、细胞类型特异性且具有机制洞察力的毒理学评估。该系统的核心价值在于，它超越了传统细胞毒性测定法（依赖延迟的功能性终点）和先前类器官芯片设计（缺乏复杂性和早期检测能力）的局限性，为临床前生殖毒性测试、机制毒理基因组学和个性化风险评估的演进奠定了坚实基础。其科学意义在于首次在一个集成平台上同时实现了对女性生殖轴复杂生理的模拟和对毒性应激的早期分子事件可视化，推动了体外毒理学模型向更高生理相关性和预测能力的发展。
研究亮点： 1. 高度仿生的集成设计：首次在单一芯片平台上同时模拟了卵巢（分阶段卵泡）和子宫内膜（分周期）的三维多细胞组织结构与双向内分泌串扰，并引入了血管内皮细胞、巨噬细胞等多种辅助细胞类型，生理复杂度高。 2. “生物标志物-报告基因”整合的创新策略：将机制研究（发现功能性生物标志物 ANGPTL4 和 SERPINB2）与技术创新（构建细胞类型特异性的荧光报告系统）紧密结合，实现了从“知其然”（检测毒性）到“知其所以然”（了解关键介导因子）的跨越，并将知识转化为高灵敏度的早期检测工具。 3. 早期预警与高内涵筛选能力：利用毒性诱导的早期转录激活事件，通过荧光信号实现快速（数小时内）、直观的毒性可视化，比基于细胞凋亡或活力丧失的传统方法具有更高的时间分辨率和灵敏度，且适用于多种毒物。 4. 面向转化的实用性：平台使用患者来源的原代细胞，并采用可扩展的3D打印和标准材料（PDMS，天然聚合物水凝胶）制造，为其在药物筛选、环境污染物评估乃至未来个性化医疗（使用患者特异性细胞）中的应用提供了可能路径。
其他有价值的讨论与展望： 研究作者在讨论部分也坦诚指出了当前平台的若干局限性，并提出了未来的发展方向： 1. 细胞类型完整性：当前子宫内膜腔室缺少对胚胎植入至关重要的腔上皮和腺上皮细胞；使用的基质细胞是人真皮成纤维细胞而非原代子宫内膜基质细胞。未来整合这些细胞将增强模型的生理保真度。 2. 上游调控缺失：平台缺少下丘脑-垂体这一调控生殖轴的上游神经内分泌单元。团队已在此前构建了下丘脑-垂体类器官芯片，未来将其与本平台整合，有望重建完整的下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，用于研究内分泌干扰物等。 3. 流体动力学模拟不足：当前是静态培养，未模拟体内的灌注和流体剪切应力。未来集成微流体灌注系统可更好地模拟激素分布、营养交换和机械传导。 4. 生物标志物面板可扩展：目前每种细胞类型仅使用一个核心生物标志物，虽然保证了结果的明确性，但可能漏检其他机制毒物。未来可考虑模块化地增加互补性生物标志物以扩大检测范围。
总而言之，这项研究代表了器官芯片技术和生殖毒理学交叉领域的一项重大进展，为开发更可靠、更人性化的药物和环境安全评估工具提供了强有力的新范式。