关于TNFα和BAFF配体-受体-细胞内衔接子复合物在脂质膜上形成高度有序簇结构的研究报告

一、 研究团队与发表信息 本研究由韩国浦项科技大学（POSTECH）生命科学系与膜蛋白研究所的Chan Seok Lim、Jisun Lee、Ji Won Kim和Jie-Oh Lee共同完成。研究成果以题为“Highly ordered clustering of TNFα and BAFF ligand-receptor-intracellular adaptor complexes on a lipid membrane”的论文形式，于2025年发表在*Nature Communications*期刊上（2025, 16:5551）。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于结构生物学与免疫学交叉领域，聚焦于肿瘤坏死因子（TNF， Tumor Necrosis Factor）家族信号传导的分子机制。TNF家族蛋白在免疫调节、细胞凋亡、增殖分化及组织稳态中扮演关键角色。其配体（如TNFα、BAFF）与相应受体（如TNFR1、BAFFR）结合后，会触发下游信号通路，是治疗自身免疫性疾病（如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮）的重要药物靶点。

尽管TNFα和BAFF的信号传导已被广泛研究，但配体结合后，受体在细胞膜上如何精确组装并启动信号的关键结构细节尚不清楚。传统的结构生物学方法，如X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM），在研究膜蛋白时面临挑战，因为截短的或去垢剂溶解的受体无法完全模拟其在天然膜环境中的状态。因此，受体在膜上是否以及如何形成更高级别的有序聚集体，以及这种聚集对信号激活是否必需，一直存在争议。本研究旨在克服这一技术障碍，直接观察并解析TNFα-TNFR1和BAFF-BAFFR等复合物在其膜锚定状态下的高分辨率簇状结构，从而阐明受体激活的结构基础。

三、 详细研究流程与方法 本研究核心是采用“脂质单层法”（lipid monolayer method）来模拟受体在细胞膜上的天然锚定状态，并结合冷冻电镜进行高分辨率结构解析。主要流程如下：

1. 蛋白表达与纯化：

   • 研究对象： 本研究涉及多种蛋白复合物，包括：TNFα与TNFR1胞外域（TNFR1ecto）或全长受体（TNFR1fl）的复合物；BAFF与BAFFR胞外域（BAFFRecto）或全长受体（BAFFRfl）的复合物；BAFF与BCMA、TACI胞外域的复合物；以及BAFF-BAFFRfl与细胞内衔接子TRAF3的复合物。此外，还包括一种非竞争性TNFR1拮抗剂纳米抗体Dom1h-574-208。
   • 表达系统： 全长受体在HEK293细胞中表达，其他蛋白（如配体、受体胞外域、TRAF3、纳米抗体）在昆虫细胞（Sf9或High Five）中表达。
   • 纯化策略： 利用组氨酸标签（His-tag）进行亲和层析纯化，随后通过凝胶过滤层析（如Superdex 200）进一步纯化，获得均一的蛋白或复合物。对于BAFF，通过控制蛋白浓度（>1.5 mg/mL）诱导其形成笼状结构（cage），并分别纯化其三聚体和笼状形式。

2. 脂质单层样品制备（核心创新方法）：

   • 原理： 该方法利用含有2-20% DGS-NTA(Ni²⁺)磷脂的混合脂质单层。磷脂的疏水脂肪酸链朝向空气，亲水头部（包括NTA-Ni²⁺）朝向水相。带有组氨酸标签的蛋白（受体或配体）通过其His-tag与脂质单层上的Ni²⁺螯合，从而被锚定在二维脂质平面上。这种方法能限制蛋白的移动，促进其侧向相互作用，并极大地简化了冷冻电镜分析，因为单层结构避免了脂质双分子层（如脂质体、纳米盘）带来的背景噪音和结构异质性难题。
   • 流程： 在特氟龙块的小孔中加入缓冲液，然后在液面上方小心加入溶解于氯仿的脂质混合物。待氯仿挥发后，形成脂质单层。随后，将含有His-tag标记蛋白的溶液注入孔中，孵育使蛋白结合到单层上。最后，将覆盖碳支持膜的冷冻电镜网格放置在液面上，使脂质-蛋白层转移到网格上，并进行 plunge-freezing冷冻。

3. 冷冻电镜数据采集与处理：

   • 数据采集： 使用配备冷冻样品台的透射电镜收集数据。为减少由于样品取向偏好（各向异性）导致的数据缺失，大多数实验采用了样品台倾斜的数据采集策略。
   • 数据处理： 使用CryoSPARC软件进行全流程处理。包括：运动校正、对比度传递函数（CTF）估计、颗粒挑选（结合Blob-picking和基于Topaz深度学习模型的方法）、多轮二维分类以筛选高质量颗粒、利用已知结构或从头建模（ab initio）生成初始模型，最后进行均一性及非均匀性三维重构（homogeneous/non-uniform refinement）。对于柔性区域（如TNFR1ecto-Dom1h复合物中的CRD4结构域和纳米抗体），采用了局部聚焦精修（focused refinement）和颗粒减法（particle subtraction）技术来提高分辨率。最终模型使用Coot和Phenix进行搭建和精修。

4. 结构与功能分析：

   • 结构比对与突变分析： 将解析出的簇状结构与已知的晶体结构进行比对（如BAFF-BAFFR笼状结构、TRAF3与BAFFR胞内肽段复合物结构）。构建并纯化了BAFF“瓣区”（flap region）的关键突变体（K216R, H218A, E223K），并利用脂质单层法观察这些突变对受体簇形成的破坏作用。
   • 拮抗剂机制研究： 解析了TNFR1非竞争性拮抗剂纳米抗体Dom1h-574-208与TNFα-TNFR1ecto复合物在溶液中和膜结合状态下的结构，探究其如何抑制受体簇形成而不影响配体结合或受体三聚化。

四、 主要研究结果 1. TNFα-TNFR1复合物在脂膜上形成多种有序簇： * 当TNFα与膜锚定的TNFR1胞外域结合后，形成了高度有序的簇状结构，而非随机聚集。主要观察到的簇类型包括：二元簇（binary， 两个三聚体单元）、弯曲簇（bent， 三个三聚体单元，最常见，占42.8%）、三角簇（trigonal）、线性四元簇（linear quadruple）和五元簇（quintuple）。 * 形成机制： 簇的形成由相邻三聚体单元中两个TNFR1受体之间的二聚化介导。这种二聚化界面主要涉及受体的CRD1和CRD4结构域。关键发现是，TNFα配体本身并不直接参与簇的形成。 降低膜上蛋白浓度有利于形成更大的延伸簇（如四元、五元簇），表明簇的形成是动态且受浓度调控的。 * 全长受体验证： 使用全长TNFR1（TNFR1fl）重复实验，发现其形成的二元簇和弯曲簇结构与胞外域复合物基本相同，胞内域和跨膜域在图中不可见，说明簇的形成主要由受体胞外域驱动，跨膜域和胞内域的贡献极小。 * 拮抗剂破坏簇结构： 非竞争性拮抗剂纳米抗体Dom1h结合在TNFR1的CRD4区域。在膜结合状态下，约60%的受体-配体复合物被解离成孤立的三聚体单元，剩余40%形成结构扭曲的二元簇。结构显示，纳米抗体破坏了CRD4二聚界面，导致两个三聚体单元相对旋转约60度。这直接证明了有序簇的形成对于TNFR1的激活是必需的，而该纳米抗体通过破坏簇的精确组装来发挥拮抗作用。

1. BAFF与其受体（BAFFR、TACI、BCMA）复合物在脂膜上形成五边形簇：

   • BAFF与膜锚定的BAFFR胞外域结合后，主要形成五边形簇（pentagonal cluster， 由五个BAFF-BAFFR三聚体单元围成一圈），此外还观察到双五边形和半球形簇。未观察到此前晶体学中报道的由60个亚基组成的完整球状笼形结构。
   • 形成机制： 与TNFR1不同，BAFF受体的簇形成由配体BAFF的“瓣区”介导。两个相邻BAFF三聚体通过其瓣区之间的强离子相互作用（如R214, K216, D222, E223）驱动五边形簇的组装。受体（BAFFR、BCMA、TACI）本身不参与簇间接触，它们位于簇的外围。
   • 受体普适性与突变效应： BAFF与另外两个受体BCMA和TACI的复合物在膜上也形成完全相同的五边形簇结构，表明五边形簇是BAFF信号通路的保守特征。BAFF瓣区的关键突变（H218A, E223K）会破坏有序簇的形成，导致形成无序聚集体。其中E223K突变（对应小鼠BAFF的E247K，已知能阻断BAFF信号但不影响受体结合）完全破坏了有序簇，这直接证明了瓣区介导的有序簇形成对BAFFR激活不可或缺。
   • 笼状结构与三聚体的等效性： 预先形成的BAFF笼状结构在结合到膜上的BAFFR后，会解离成五边形簇。这解释了为何在体液中主要以三聚体形式存在的BAFF，与人工形成的笼状BAFF具有相同的生物学活性——因为它们在与膜受体结合后都形成了相同的五边形激活簇。

2. 细胞内衔接子TRAF3结合诱导BAFF-BAFFR簇发生结构转变：

   • 当细胞内衔接子TRAF3结合到BAFF-BAFFRfl复合物的胞内域后，诱导了簇结构的根本性转变：从五边形簇转变为扁平的六边形晶格（hexagonal lattice）结构。
   • 结构细节： 高分辨率结构显示，TRAF3通过其TRAF-C结构域与BAFFR胞内短肽结合。三个BAFF-BAFFR-TRAF3三聚体单元通过TRAF3分子之间以及TRAF3与BAFFR胞内域之间的相互作用，组装成六边形排列。TRAF3的卷曲螺旋（coiled-coil）结构域像长杆一样伸出，但不参与簇间的相互作用。
   • 转变意义： 这种从五边形（108°夹角）到六边形（120°夹角）的扁平化结构重排，可能为了最大化TRAF3与BAFFR胞内域的结合（五边形簇无法实现1：1的化学计量比），从而启动下游信号。研究提出了BAFFR的激活模型：配体结合诱导受体三聚化 → 三聚体在膜上主要组装成五边形簇 → TRAF3结合诱导结构转变为六边形簇 → 启动细胞内信号。

五、 研究结论与意义 本研究首次在近原子分辨率下直接揭示了TNF受体家族成员TNFR1和BAFFR在配体诱导下，于模拟细胞膜的环境中形成高度有序的特定空间簇，并且这种有序簇的形成是其信号激活所必需的关键步骤。

• 科学价值：

  1. 验证并深化了“扩展网络假说”： 为TNF受体激活的“扩展网络假说”提供了首个高分辨率结构证据，表明配体结合后受体确实会形成有限的、有序的高级聚集体（簇），而非简单的三聚化即足够。
  2. 阐明了拮抗与失活突变的结构基础： 从结构上解释了非竞争性拮抗剂（Dom1h纳米抗体）和BAFF功能丧失突变（如E223K）的作用机制——它们并非阻断配体结合或受体三聚化，而是通过破坏有序簇的精确几何构型来抑制信号传导。
  3. 揭示了BAFF信号激活的新范式： 明确了BAFF通过其“瓣区”介导五边形簇形成来激活受体，并且TRAF3的结合会驱动该五边形簇向六边形簇转变，这为理解BAFF信号从膜外到膜内的传递提供了清晰的分子框架。
  4. 展示了脂质单层冷冻电镜方法的强大能力： 成功应用并验证了脂质单层法在研究膜蛋白高级组装体结构中的独特优势，为研究其他难以捕捉的、膜依赖的、脆弱的蛋白复合物簇提供了强有力的新工具。

• 应用价值： 该研究为针对TNF家族受体的药物研发提供了新的思路和靶点。未来可以设计能够特异性稳定或破坏这些有序受体簇的小分子或生物制剂，从而更精确地调控免疫信号，用于治疗自身免疫性疾病、炎症或癌症。

六、 研究亮点 1. 方法学创新： 成功将脂质单层法与冷冻电镜结合，克服了传统方法难以研究膜蛋白天然状态下高级组装的瓶颈，首次解析了TNFα-TNFR1和BAFF-BAFFR在膜环境下的高分辨率簇状结构。 2. 关键发现： 明确证明了有序簇的形成是TNFR1和BAFFR激活的普遍且必需的步骤，而不仅仅是配体结合或受体三聚化。 3. 机制深入： 不仅观察到了静态的簇结构，还捕捉到了动态的结构转变——即TRAF3结合诱导BAFF-BAFFR从五边形簇向六边形簇的转变，将胞外簇组装与胞内信号衔接直接联系起来。 4. 结构与功能完美衔接： 通过结合拮抗剂结构和功能丧失突变体的结构分析，直接将观察到的结构特征与已知的生物学功能（激活或抑制）相关联，使结论非常坚实。

七、 其他有价值内容 研究还讨论了脂质单层在促进簇形成中可能扮演的双重角色：(1) 将蛋白质限制在粘性的二维层中，由于熵效应增强了蛋白质分子间的侧向相互作用；(2) 限制了受体-配体复合物的可能形状，例如迫使在溶液中呈球状的BAFF-BAFFR笼状结构在平面上解离并重排为五边形簇。此外，作者也指出了该方法的局限性，如图像的各向异性问题，并建议该方法最适合用于研究已知单体/三聚体结构的蛋白质的聚集模式。最后，作者提出，其他TNF家族受体以及许多其他类型的单次跨膜受体（如GPCRs、离子通道）可能也通过类似的有序簇机制发挥作用，脂质单层法在此类研究中具有广泛的应用前景。