关于《国际生物科学杂志》（*International Journal of Biological Sciences*）2024年发表的“NAD+前体烟酰胺核糖苷可挽救阿尔珀斯病iPSC来源皮质类器官中的线粒体缺陷和神经元丢失”一文的学术报告
本研究由来自挪威卑尔根大学临床医学系（K1）的Kristina Xiao Liang教授团队主导，联合了挪威奥斯陆大学、中国四川大学、捷克查理大学等多家国际机构的研究人员共同完成。该研究作为研究论文（Research Paper）于2024年1月25日在线发表于学术期刊《国际生物科学杂志》（*International Journal of Biological Sciences*， 2024, Vol. 20, Issue 4）。
一、 研究的学术背景
本研究属于神经退行性疾病与干细胞模型交叉领域，聚焦于一种罕见的、致命的儿童期发病神经退行性疾病——阿尔珀斯综合征（Alpers’ syndrome）。该病通常由编码线粒体DNA（mtDNA）复制关键酶——聚合酶γ（polymerase-gamma, POLG）催化亚基的基因发生双等位基因致病性变异引起。其临床特征包括难治性癫痫、发育倒退、肌张力低下等，目前尚无有效疗法，患者常因药物难治性癫痫持续状态而死亡。由于缺乏能够准确模拟人类大脑复杂微环境和疾病病理的良好实验模型，阿尔珀斯病的潜在发病机制仍不明确，这严重阻碍了治疗策略的开发。
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）技术的出现为在体外研究人类疾病，特别是神经系统疾病，提供了革命性工具。患者来源的iPSCs能够保留个体的遗传突变，并可分化为各类受累细胞类型，包括近年来快速发展的三维（3D）脑类器官（brain organoids），后者能更好地模拟体内大脑的结构和细胞相互作用。另一方面，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是细胞能量代谢和线粒体功能的核心分子，其前体物质如烟酰胺核糖苷（Nicotinamide Riboside, NR）在多种神经退行性疾病模型中被证明具有神经保护作用。
基于此，本研究旨在：1）利用阿尔珀斯病患者的皮肤成纤维细胞建立iPSCs模型，并进一步分化为神经干细胞（neural stem cells, NSCs）和3D皮质类器官，以构建能够模拟患者大脑病理特征的体外研究平台；2）利用该平台深入探究阿尔珀斯病的神经功能障碍机制，特别是线粒体缺陷的细胞类型特异性表现；3）评估NAD+前体NR作为潜在治疗策略在该疾病模型中的疗效。
二、 研究的详细工作流程
本研究包含多个相互关联的实验流程，构建了一个从二维细胞到三维组织的完整疾病建模与药物测试体系。
流程一：患者特异性iPSCs及NSCs的建立与表征。 研究团队从一名携带POLG基因复合杂合突变（A467T和P589L）的阿尔珀斯病患者身上获取皮肤成纤维细胞。利用仙台病毒载体携带OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子，将患者和健康对照的成纤维细胞重编程为iPSCs。通过流式细胞术、免疫荧光染色及Sanger测序验证了iPSCs的多能性标志物表达（如NANOG、OCT4、SSEA4）以及POLG突变的存在。随后，使用已发表的方法将iPSCs分化为NSCs，并通过形态学观察、免疫荧光染色（NESTIN, SOX2）和流式细胞术确认了NSCs的身份和纯度。在实验设计中，研究者使用了来自三名不同健康供体的五个iPSCs克隆作为对照，以增加结果的可靠性。
流程二：线粒体功能与代谢的系统性评估。 在成功建立iPSCs和NSCs模型后，研究团队对患者和对照来源的iPSCs及NSCs进行了一系列详尽的线粒体功能与代谢表型分析。所有分析均主要采用流式细胞术进行高通量、单细胞水平的定量。 1. 线粒体质量与膜电位：使用MitoTracker Green（MTG）染色评估线粒体质量（体积），使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色评估线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP），并计算单位线粒体的特异性MMP（TMRE/MTG比值）。 2. 活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平：使用DCFDA染料检测总细胞内ROS，使用MitoSOX Red染料特异性检测线粒体来源的ROS（mito-ROS），并利用MitoTracker Deep Red（MTDR）或MTG进行标准化，计算单位线粒体的ROS产生。 3. 能量代谢：使用化学发光法检测细胞内ATP水平；使用比色法检测乳酸（L-lactate）生成，作为糖酵解活性的指标。 4. 线粒体DNA（mtDNA）拷贝数：采用两种方法间接评估。一是通过流式细胞术检测线粒体转录因子A（TFAM，与mtDNA以摩尔比结合）和线粒体外膜蛋白TOMM20的水平，并计算TFAM/TOMM20比值；二是通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测mtDNA编码基因ND1相对于核基因APP的相对拷贝数。 5. 氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）复合物水平：使用针对复合物I（CI）亚基NDUFB10、复合物II（CII）亚基SDHA、复合物IV（CIV）亚基COXIV的抗体，通过流式细胞术检测这些蛋白的总量，并利用TOMM20进行标准化，评估单位线粒体上的复合物丰度。
流程三：转录组学分析。 为了在基因表达层面探究疾病机制，研究对患者和对照的iPSCs、NSCs以及后续的皮质类器官进行了RNA测序（RNA-seq）分析。数据处理流程包括：使用Trimmomatic去除低质量序列和接头；使用Salon软件进行转录本定量，并利用tximport R包汇总为基因水平计数；使用DESeq2 R包进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析；使用clusterProfiler R包进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路和基因本体论（GO）富集分析。主成分分析（PCA）用于评估样本间的整体表达差异。
流程四：三维皮质类器官的生成与病理表征。 研究采用已发表的方案，将iPSCs分化为3D皮质类器官。流程包括：形成拟胚体（embryoid body, EB）、神经诱导、模式化（使用SMAD和Wnt通路抑制剂促进皮质命运）以及长期成熟培养（长达90天）。通过免疫荧光染色对类器官进行全面的组织学和病理学评估，使用的标志物包括：成熟神经元标志物MAP2和NeuN，皮质神经元层特异性标志物SATB2（上层）和CTIP2（中层），神经前体细胞标志物SOX2，星形胶质细胞标志物GFAP，中间神经元标志物GAD65，以及线粒体标志物NDUFB10（CI）、TFAM和VDAC。通过共聚焦显微镜成像，并使用ImageJ软件对荧光信号强度进行定量分析，以比较患者与对照类器官在神经元数量、胶质细胞增生、线粒体蛋白表达等方面的差异。
流程五：NR治疗的干预研究。 为了测试NR的治疗潜力，研究对培养至一个月的患者来源皮质类器官进行了为期两个月的长期干预，在培养基中添加1 mM的NR，每三天更换一次。干预结束后，对类器官进行与流程四相同的形态学观察、免疫荧光染色定量分析以及RNA-seq转录组学分析，以评估NR对类器官病理表型和基因表达谱的挽救效果。
三、 研究的主要结果
结果一：阿尔珀斯病iPSCs表现出轻微的线粒体功能损伤。 与对照相比，患者iPSCs显示出线粒体体积和总MMP降低，但特异性MMP无差异。ROS产生总量较低，但单位线粒体ROS无差异。ATP产量正常，但乳酸生成增加，提示糖酵解可能增强。最显著的发现是，无论总量还是特异性水平，复合物I（CI）的蛋白表达均显著降低，而复合物IV（CIV）无变化。mtDNA拷贝数（通过TFAM和qPCR评估）也未显示显著差异。这表明在未分化的多能干细胞阶段，POLG突变已导致特定的线粒体缺陷（尤其是CI缺乏），但整体能量代谢障碍尚不严重，可能与iPSCs本身更依赖糖酵解供能有关。
结果二：阿尔珀斯病NSCs表现出更严重的线粒体功能障碍。 当iPSCs分化为NSCs后，疾病表型急剧恶化。患者NSCs表现出特异性MMP降低、ATP产量显著下降、乳酸生成进一步增加。更重要的是，细胞内ROS和线粒体ROS（包括总量和特异性水平）均显著升高。线粒体DNA拷贝数通过TFAM/TOMM20比值和qPCR均证实明显耗竭。与此一致，OXPHOS复合物蛋白水平分析显示，CI和CIV（包括总量和特异性水平）均显著降低。转录组分析进一步支持了这些发现：患者NSCs中与线粒体NADH氧化还原酶（即CI）相关的通路显著下调，而糖酵解和糖异生通路则上调，这证实了细胞通过增强糖酵解来补偿受损的氧化磷酸化。此外，抗氧化防御基因（如CAT, GPX1）表达改变，促凋亡和抗凋亡基因表达谱也发生复杂变化，提示细胞处于氧化应激状态并启动了适应性反应。
结果三：阿尔珀斯病皮质类器官重现患者大脑的病理特征。 患者来源的皮质类器官在形态上表现出皮层折叠不规则、分层结构异常。定量免疫荧光分析揭示了关键的病理变化：1）皮层神经元丢失：成熟神经元标志物MAP2、NeuN、Tuj1，以及皮层特异性神经元标志物SATB2和CTIP2的表达均显著降低。2）星形胶质细胞增生：星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞数量显著增加。3）神经前体细胞累积：SOX2阳性神经前体细胞增多，提示神经元分化或成熟受阻。4）线粒体缺陷：类器官中CI蛋白NDUFB10、TFAM（指示mtDNA）以及线粒体质量标志物VDAC的表达均显著下降。这些发现与阿尔珀斯病患者尸检脑组织观察到的皮层神经元丢失、星形胶质细胞增生和线粒体CI缺乏等病理特征高度吻合。
结果四：皮质类器官的转录组谱揭示通路水平失调。 RNA-seq分析显示，患者类器官与对照类器官在基因表达上形成明显分离。通路富集分析发现：1）下调通路：包括线粒体电子传递、线粒体tRNA加工、线粒体运输等线粒体相关通路；以及突触前传递、突触小泡胞吐、突触后受体活性等突触发生与功能通路。特别值得注意的是，GABA能突触传递通路下调，这与阿尔珀斯病的癫痫表型可能相关。2）上调通路：包括星形胶质细胞发育、胶质细胞活化等胶质细胞相关通路，以及神经炎症相关通路。这从分子层面证实了类器官模型中存在的胶质增生和神经炎症反应。
结果五：NR治疗部分挽救类器官的病理表型。 长期NR治疗显著改善了患者皮质类器官的病理状况。形态上，类器官结构更为规整。免疫荧光定量显示：1）神经元恢复：MAP2、Tuj1、SATB2、CTIP2等神经元标志物表达增加。2）胶质增生减轻：GFAP阳性星形胶质细胞数量减少。3）线粒体功能改善：CI蛋白NDUFB10和TFAM表达升高。4）中间神经元标志物GAD65表达增加。转录组分析进一步证实了NR的疗效：经NR治疗后，患者类器官的整体基因表达谱向健康对照方向偏移。GSEA显示，之前下调的线粒体功能相关通路（如电子传递、线粒体运输）和突触相关通路（如GABA能突触传递调控）被上调；而之前上调的星形胶质细胞/胶质细胞相关通路和神经炎症通路则被下调。
四、 研究的结论与意义
本研究成功构建了首个基于阿尔珀斯病患者iPSCs的NSCs和3D皮质类器官模型，该模型能够高度模拟患者大脑的关键病理特征，包括皮层神经元丢失、星形胶质细胞增生、mtDNA耗竭和线粒体CI缺乏。研究首次系统揭示了POLG突变导致的线粒体功能障碍具有细胞类型特异性：在iPSCs中表现轻微，而在分化为高度依赖氧化磷酸化的NSCs和皮层神经元时则变得极为严重。这为理解阿尔珀斯病为何主要影响神经系统提供了重要线索。
更重要的是，本研究首次在阿尔珀斯病模型中证明了NAD+前体NR的治疗潜力。长期NR治疗能够部分逆转皮质类器官中的神经元丢失、胶质增生和线粒体缺陷，并纠正相关的异常基因表达通路。这为将NR推向阿尔珀斯病乃至其他具有类似线粒体病因的疾病的临床试验提供了坚实的临床前证据。
五、 研究的亮点
六、 其他有价值的要点
研究也坦诚地指出了其局限性，主要包括：由于阿尔珀斯病极为罕见，本研究仅基于一名患者的iPSCs系（两个克隆）进行，样本量较小；尽管使用了多个健康对照克隆，但未能成功构建同基因型对照（isogenic control）以完全排除遗传背景干扰。这些局限性需要在未来通过收集更多患者样本、优化基因编辑技术等方式加以克服。尽管如此，本研究为理解并治疗这种毁灭性疾病迈出了关键一步，确立了一个强大的临床前研究平台。