garrido et al., sci. transl. med. 10, eaat6420 (2018) 21 november 2018 s c i e n c e t r a n s l a t i o n a l m e d i c i n e | r e s e a r c h a r t i c l e
研究学术报告
本报告旨在介绍一项关于利用人源单克隆抗体治疗汉坦病毒心肺综合征（HCPS）的重要研究成果。该研究由Jose L. Garrido、Joseph Prescott、Mario Calvo、Felipe Bravo、Raymond Alvarez、Alexis Salas、Raul Riquelme、Maria L. Rios-eco、Brandi N. Williamson、Elaine Haddock、Heinz Feldmann和Maria I. Barria*（通讯作者）等人合作完成，于2018年11月21日发表于《Science Translational Medicine》期刊第10卷第468期。研究人员来自多个机构，包括智利康塞普西翁大学、Ichor Biologics LLC、美国科罗拉多州立大学、德国罗伯特·科赫研究所、智利瓦尔迪维亚大学、蒙特港地区医院以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏和传染病研究所（NIAID）落基山实验室。本研究在病毒学和免疫治疗领域取得了突破性进展。
学术背景与研究目的
本研究的主要科学领域是病毒免疫学和抗体治疗学。研究对象是安第斯汉坦病毒（Andes virus， ANDV），该病毒是南美洲汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus cardiopulmonary syndrome， HCPS）的主要病原体。HCPS是一种严重的传染病，初期表现为发热、头痛和胃肠道症状，随后可迅速发展为低血压、肺衰竭和心源性休克，致死率高达25%至40%。目前尚无美国食品药品监督管理局批准的特异性治疗药物或预防疫苗。
研究的发起基于几个关键背景：首先，多项研究已表明，产生中和抗体（Neutralizing antibody）反应与人类HCPS患者的生存率有很强的相关性。其次，从HCPS幸存者身上采集的恢复期免疫血浆输注给急性患者可以降低死亡率，这提示抗体在体内控制汉坦病毒感染方面具有重要且实用的作用。然而，使用多克隆抗体产品存在病原体污染风险、生产成本高、批次间变异性以及绝大多数抗体为非中和性抗体等局限性。
因此，本研究旨在探索利用中和性单克隆抗体作为治疗HCPS的潜在治疗剂。具体目标是：从ANDV感染后康复的HCPS幸存者中，筛选出具有高结合力与强中和活性的个体；从其体内分离ANDV糖蛋白特异性记忆B细胞，克隆并重组表达人源免疫球蛋白G（IgG）单克隆抗体；在体外鉴定这些抗体的结合与中和能力；并最终在叙利亚仓鼠ANDV感染模型中，评估这些抗体作为暴露后疗法的体内保护效果。
详细研究流程
本研究包含一个连贯且多步骤的实验流程，主要可分为以下几个关键阶段：
第一阶段：高活性抗体供体的筛选 研究对象为27名来自智利南部多次ANDV疫情爆发后的HCPS康复患者（恢复期个体， P1-P27）以及5名健康对照（C1-C5）。研究人员首先开发了细胞基结合力测定法，以量化血清中针对ANDV糖蛋白（Glycoprotein， GP）的特异性IgG抗体。具体方法是将293T细胞转染ANDV-GP表达质粒，使其细胞表面表达ANDV-GP（即ANDV-GP-293T细胞），然后将这些细胞与患者血清（1:1000稀释）孵育，通过流式细胞术检测荧光标记的二抗结合情况。为了更精确地量化结合，研究人员采用了抗体结合指数（Antibody binding index）这一指标，该指数综合了阳性细胞百分比和平均荧光强度。
随后，研究人员评估了血清的中和活性。由于直接使用活病毒需要生物安全3级或4级实验室，他们构建了一种安全的假病毒（Pseudovirus， PV）中和测定系统。该系统利用包被了ANDV-GP的假病毒感染稳定表达其假定受体β3整合素（β3 integrin）的HEK293-IB3靶细胞。假病毒在成功感染后会表达绿色荧光蛋白（GFP），从而可以通过流式细胞术定量感染细胞的比例来评估中和效果。实验将ANDV假病毒与不同稀释度（从1:50至1:20,000）的患者血清预孵育，然后感染靶细胞，通过计算抑制50%感染所需的浓度（IC50）来比较不同血清的中和能力。作为非特异性抑制对照，还使用了囊膜为水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的假病毒进行平行实验。
第二阶段：记忆B细胞的分离与单克隆抗体的克隆 从筛选出的患者中，研究者选择了同时具有高结合指数（P10， 87倍于阴性对照）和高中和能力（30倍于阴性对照）的个体P10作为抗体克隆的供体。从其外周血单个核细胞（PBMCs）中分离ANDV-GP特异性记忆B细胞。分离方法涉及使用一个抗体和荧光标记的“诱饵”支架（bait scaffold）组合进行细胞标记，具体包括抗CD19、抗CD27、抗IgM抗体以及荧光标记的ANDV-GP诱饵。通过流式细胞分选仪（BD FACSaria II），分选出CD19+/CD27+/IgM-/诱饵+的单个记忆B细胞。在供体P10中，ANDV-GP特异性IgG+记忆B细胞的频率约为4.99%。共分选了400个此类单细胞。
对分选出的单细胞，通过两步逆转录和巢式聚合酶链式反应（nested PCR）扩增其抗体重链和轻链的互补决定区（可变区， VH和VL）。对40对成功匹配的重链和轻链序列进行测序分析，揭示了其序列异质性。使用特定接头，将可变区基因克隆到含有人IgG1恒定区（IgG1 constant region）的表达载体中，转染293T细胞以重组表达全长IgG。最终，基于其高结合和高中和活性，筛选出两个单克隆抗体（mAb）候选株：JL16和MIB22，用于后续的深入表征。序列分析显示，JL16和MIB22的重链和轻链胚系基因来源不同，提示它们识别不同的表位。
第三阶段：单克隆抗体的体外表征 研究人员对JL16和MIB22进行了全面的体外功能评估： 1. 结合活性：将表达ANDV-GP、VSV-G或未转染（Mock）的293T细胞与不同浓度的纯化抗体（1-15 μg/ml）孵育，通过流式细胞术检测结合。结果显示，JL16、MIB22以及P10的多克隆IgG均能特异性结合ANDV-GP表达细胞，而不结合VSV-G或Mock细胞。 2. 中和活性： * 假病毒中和实验：将ANDV假病毒与不同浓度的抗体预孵育，然后感染HEK293-IB3细胞。结果显示，MIB22的中和能力比JL16强32倍（IC50: 0.205 μg/ml vs. 6.60 μg/ml），比P10多克隆IgG强67倍。 * 活病毒中和实验：采用焦点减少中和试验（Focus reduction neutralization test， FRNT80），使用活ANDV感染Vero E6细胞。结果显示，MIB22的FRNT80为0.14 μg/ml，而JL16为15.35 μg/ml，进一步证实了MIB22具有更强的体外中和活性。 3. 相对亲和力：通过流式细胞术测量了抗体的解离速率。在37°C孵育不同时间后，JL16在120分钟后仍保持80%的初始结合水平，而MIB22和P10多克隆IgG分别降至54%和68%。这表明JL16对ANDV-GP的相对亲和力更高。 4. 表位竞争性分析：分别用量子点（Quantum dot， Qdot）标记JL16和MIB22，进行竞争性结合实验。结果显示，即使存在饱和浓度的另一种抗体，每种抗体的结合信号依然能随自身浓度增加而增强，表明JL16和MIB22识别ANDV-GP上不同的区域，互不干扰，支持了它们可以联合使用的可能性。 5. 其他表征：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）证实两种抗体均可结合ANDV假病毒颗粒。通过共聚焦显微镜观察，证实了MIB22能特异性结合细胞表面表达的ANDV-GP。
第四阶段：体内保护性功效评估 为了验证JL16和MIB22在体内的治疗效果，研究采用了叙利亚仓鼠ANDV感染模型，该模型能很好地重现人类HCPS的致命性病理特征。24只雌性叙利亚仓鼠通过鼻内途径接种200个灶形成单位（FFU）的致死剂量ANDV。随后将它们分为四组，每组6只，在感染后第3天和第8天通过腹腔注射进行治疗： * 对照组：注射50 mg/kg的同型对照抗体（Isotype control IgG）。 * JL16治疗组：注射50 mg/kg的JL16抗体。 * MIB22治疗组：注射50 mg/kg的MIB22抗体。 * 联合治疗组：注射25 mg/kg的JL16和25 mg/kg的MIB22的混合抗体（总剂量仍为50 mg/kg）。 每天监测动物的疾病症状和存活情况。所有幸存动物在感染后第36天被安乐死，采集血清和肺组织进行后续分析。为了确认感染确实发生（即抗体是在病毒已建立感染后起效的），对所有安乐死动物的血清进行了ANDV核蛋白（N蛋白）特异性ELISA检测。此外，通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测了肺组织中ANDV S片段RNA的拷贝数，以评估病毒清除情况。
主要研究结果
筛选结果：在27名康复患者中，观察到针对ANDV-GP的IgG结合力存在很大差异，平均结合指数显著高于健康对照。中和实验也显示中和活性范围很广。根据中和能力将患者分为低（<5倍）、中（5-25倍）、高（>25倍）三组。最终，结合高结合指数和高中和能力，选择了P10作为单克隆抗体克隆的供体。
抗体克隆结果：成功从P10体内分离出ANDV-GP特异性记忆B细胞，并克隆表达了40对重轻链配对的抗体。其中，JL16和MIB22展现出优异的体外活性。序列分析证实它们源自不同的胚系基因家族，且无克隆相关性。
体外表征结果： 1. 结合与中和：JL16和MIB22均能有效结合并中和ANDV。一个有趣的发现是，尽管JL16的体外中和活性（IC50 = 6.60 μg/ml）低于MIB22（IC50 = 0.205 μg/ml），但其相对亲和力更高（解离更慢）。这一“高亲和力但中和活性相对较弱”的现象，提示抗体介导的保护机制可能不仅仅是中和作用。 2. 表位差异：竞争性结合实验表明JL16和MIB22识别不同的表位，这为将它们组合成“鸡尾酒疗法”以防止病毒逃逸突变提供了理论基础。
体内保护结果： 1. 生存率：接受同型对照抗体的所有仓鼠均在感染后10-15天内死亡。而接受JL16、MIB22单药治疗或联合治疗的三个组，所有动物（每组6只）均存活至实验终点（36天），保护率达到100%。统计学分析（对数秩检验）显示治疗组的生存率与对照组有极显著差异（p < 0.0001）。 2. 感染确认：所有安乐死仓鼠的血清ANDV-N抗体滴度均≥12,800，证实了ANDV感染确实在治疗前就已成功建立。 3. 病毒清除：qRT-PCR检测肺组织中的病毒RNA残留。结果显示，在MIB22单药治疗组和联合治疗组中，各有3只动物检测到低水平的病毒RNA。然而，在JL16单药治疗组的所有6只动物肺组织中，均未检测到可测量的ANDV S片段RNA。这个结果非常关键，它表明尽管JL16的体外中和活性较弱，但在体内它可能通过更强的亲和力或其他免疫效应机制（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体介导的病毒裂解），更有效地清除了病毒。
研究结论与意义
本研究的结论是，从ANDV康复者体内克隆得到的两种重组人源单克隆抗体JL16和MIB22，在叙利亚仓鼠模型中作为暴露后疗法，能够提供100%的保护，抵御致死剂量的ANDV感染。研究表明，无论是单药治疗（特别是JL16）还是两种抗体的联合应用，都有望成为一种有效的临床治疗策略。
科学价值：本研究首次成功地从ANDV康复者体内分离并鉴定了具有强效中和活性和高亲和力的人源单克隆抗体，并系统评估了其在动物模型中的治疗潜力。它证实了针对病毒糖蛋白的中和抗体是治疗HCPS的有效手段。此外，研究揭示了抗体介导保护作用的复杂性：JL16的例子表明，抗体在体内的保护功效不仅取决于其中和活性，亲和力和其他免疫效应功能也至关重要。
应用价值：本研究为开发针对ANDV感染（乃至其他新世界汉坦病毒）的被动免疫疗法奠定了坚实的基础。相较于传统的恢复期血浆疗法，单克隆抗体疗法具有批次均一、纯度可控、可规模化生产、安全性更高（无潜在病原体污染）以及成分明确（主要为中和性抗体）等显著优势。抗体疗法不仅可用于治疗确诊患者，也可能用于高危人群（如医护人员、实验室人员或疫情暴发区居民）的暴露后预防。
研究亮点与创新
这项研究是一项从临床需求出发，结合前沿免疫学技术，并最终在动物模型中得到成功验证的优秀转化医学研究范例，为汉坦病毒相关疾病的防治开辟了新的路径。