北京大学药学院的Meng Sha、Wang Yao、Xiao Zhang和Zhongjun Li（通讯作者）团队在《Tetrahedron Letters》期刊（2017年6月）发表了题为《Synthesis of structure-defined branched hyaluronan tetrasaccharide glycoclusters》的研究论文。该研究通过酶解天然透明质酸（hyaluronan, HA）获得四糖单元（tetrasaccharide, HA4），首次高效合成了结构明确、分子量范围广的糖簇（glycocluster），为揭示透明质酸分子量依赖的生物活性机制提供了新型工具。

学术背景

透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）通过β(1→3)和β(1→4)糖苷键交替连接而成的线性糖胺聚糖（glycosaminoglycan）。其生物活性与分子量密切相关：高分子量透明质酸（HMW-HA, >100 kDa）具有抗炎和促进组织修复作用，而低分子量透明质酸（LMW-HA, 数万Da）和寡糖（o-HA, 数千Da）可能诱导促炎反应。这种”分子量-活性”关系的机制尚不明确，部分原因是天然HA的分子量异质性导致研究材料难以标准化。糖簇技术通过模拟天然糖类与蛋白质的多价相互作用（multivalent interactions），为这一难题提供了解决方案。本研究旨在合成结构确定的HA4糖簇，构建分子量可控的模型分子。

研究流程

1. HA四糖单元的大规模酶法制备

研究采用牛睾丸透明质酸酶（bovine testicular hyaluronidase, BTH）在pH 5.0的NaOAc/NaCl缓冲体系中降解50克HMW-HA（500 kDa）。通过两周的酶解反应获得以HA4为主的寡糖混合物，经加热过滤去除酶后，直接进行全乙酰化保护（3步总产率42%），避免了传统色谱纯化的繁琐步骤，最终得到23克全保护HA4（化合物1）。

2. 糖簇构建块的合成创新

针对HA1位羟基糖苷化反应的难点，团队开发了新策略：
- 先用3-二甲氨基丙胺（DMAPA）选择性脱除还原端乙酰基，转化为三氯乙酰亚胺酯（化合物2）
- 在三甲基硅三氟甲磺酸酯（TMSOTf）催化下生成恶唑啉中间体（化合物3，收率85%）
- 以CuCl2为催化剂，在氯仿中与叠氮醇 linker 7 或炔丙醇发生糖苷化反应，分别得到叠氮化（化合物4，收率88%）和炔基化（化合物5，收率81%）HA4构建块

3. 多价支架设计与糖簇组装

选用三类支架分子：
- 多元醇衍生物（8a-b）：通过CuAAC反应与化合物4组装，经脱保护得到糖簇10a-b（收率>99%）
- PAMAM树枝状分子（11c-d）：G1（8氨基）和G2（16氨基）代PAMAM经己炔酸修饰后，与化合物6点击化学连接，获得12c（9.6 kDa）和12d（22.4 kDa）
- GATG树枝状分子（13e-g）：含末端叠氮的G1-G3代支架直接与化合物5反应，合成14e（3.1 kDa）、14f（9.8 kDa）和14g（30 kDa）

采用两种组装策略：策略I（先组装后脱保护）适用于多元醇体系；策略II（先脱保护后组装）用于对氧化敏感的PAMAM支架。糖簇通过MALDI-TOF MS和尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）表征，发现GATG糖簇可能存在聚合现象（14f实测分子量为计算值2倍）。

主要结果

1. 酶解工艺优化：建立无需色谱纯化的直接保护法，从50克HMW-HA获得23克全保护HA4（3步42%），较传统方法效率显著提升。
   
2. 糖苷化方法创新：恶唑啉中间体路线解决了N-乙酰糖苷化难题，关键步骤收率达85-88%。
   
3. 糖簇库构建：成功合成5类糖簇（9a-b、12c-d、14e-g），分子量覆盖3-30 kDa，其中30 kDa的14g是目前报道最大的结构确定四糖簇。
   
4. 分析技术组合：SEC-MALS弥补了MALDI-TOF对大分子糖簇的分析局限，发现支架依赖性聚合现象。
   

结论与价值

该研究首次实现了：
1. 结构明确的HA4糖簇规模化合成（克级），为研究HA分子量-活性关系提供标准化工具；
2. 开发恶唑啉介导的HA1位糖苷化新方法，克服N-乙酰糖苷化传统难题；
3. 构建分子量精确可控的糖簇库（3-30 kDa），可模拟不同聚合度HA的生物活性。

科学价值在于：
- 为糖胺聚糖的多价相互作用机制研究建立分子平台
- 推动糖簇在药物开发（如HA受体靶向治疗）中的应用
- 为其他糖胺聚糖（如硫酸软骨素）糖簇合成提供方法论参考

研究亮点

1. 方法创新性：
   
   • 酶解-保护一体化工艺避免色谱纯化
     
   • 恶唑啉中间体策略实现HA1位高效糖苷化
     
2. 技术整合性：结合CuAAC点击化学与树枝状聚合物技术，构建分子量跨度达10倍的糖簇库
   
3. 应用前瞻性：合成的糖簇可用于CD44、RHAMM等HA受体的机制研究，以及炎症调控、肿瘤靶向等生物医学领域。
   

其他价值

研究获得国家自然科学基金（21472007）支持，补充材料包含详细的实验步骤和表征数据。团队提出的”分子量-支架-活性”研究框架，为糖簇的精准设计提供了新思路。