本研究由巴西圣保罗州立大学（Sao Paulo State University—UNESP）基因组研究实验室的 Mariana N. Batista、Ana Cláudia S. Braga、Marilia Freitas Calmon 和 Paula Rahal 等人，联合巴西 Famerp 医学院 Maurício L. Nogueira、马托格罗索联邦大学 Bruno M. Carneiro，以及圣保罗州立大学生物分子创新多用户中心 Ricardo B. Mariutti 和 Raghuvir Krishnaswamy Arni 共同完成。该研究于 2019 年 1 月 11 日发表在病毒学专业期刊 Viruses 上，文章标题为《从东方草药中分离的天然产物可灭活寨卡病毒》（Natural Products Isolated from Oriental Medicinal Herbs Inactivate Zika Virus）。

本研究属于抗病毒药物发现与天然产物药理学交叉领域。寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），最早于 1952 年在乌干达寨卡森林中被发现。长期以来寨卡病毒感染仅引起轻微症状，但 2015 年该病毒在巴西大规模流行后，研究者发现孕妇感染寨卡病毒与胎儿小头畸形（microcephaly）及其他神经系统发育异常存在密切关联。此外，寨卡病毒还可穿过胎盘、感染神经祖细胞并破坏神经发育，在成人中也可能引发格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome）。面对寨卡病毒对公共健康的严重威胁，开发疫苗和筛选能够抑制病毒生命周期不同阶段的小分子化合物成为重要研究方向。小檗碱（berberine）是一种异喹啉生物碱，属于原小檗碱类结构，存在于小檗属植物如 Berberis vulgaris 中。大黄素（emodin）是一种蒽醌衍生物，主要来源于掌叶大黄、何首乌、芦荟和决明子等传统药用植物。已有研究表明，小檗碱对巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒、基孔肯雅病毒等具有抑制活性；大黄素则对柯萨奇病毒 B5 型、呼吸道合胞病毒、流感 A 型病毒、EB 病毒、乙型肝炎病毒以及同为黄病毒属的日本脑炎病毒具有抗病毒作用。然而，小檗碱和大黄素是否能直接灭活寨卡病毒颗粒此前尚不清楚。基于此背景，本研究系统评价了这两种天然化合物对寨卡病毒的体外抑制作用，并重点考察其直接作用于病毒颗粒的杀病毒（virucidal）效应。

在实验设计与流程方面，本研究首先将小檗碱和大黄素分别用 0.2% 二甲基亚砜（DMSO）配制成储备液，再用 DMEM 培养基稀释为不同浓度的工作液。研究使用 Vero E6 细胞（非洲绿猴肾细胞系，ATCC CRL-1586）作为宿主细胞模型，并以从巴西东北部发热患者中分离得到的寨卡病毒巴西株作为测试病毒。病毒在 Aedes albopictus 蚊虫细胞 C6/36（ATCC CRL-1660）中扩增培养 10 至 14 天，直至出现细胞病变效应，所有实验均使用同一代次病毒。研究共包括五个主要实验步骤。第一步是细胞毒性实验：将 Vero E6 细胞以每孔 5 × 10³ 个细胞接种至 96 孔板，培养 24 小时后，分别加入不同浓度小檗碱（0–475 µM）和大黄素（0–80 µM），在给药后 24、48 和 72 小时采用 MTT 法检测细胞活力。第二步是杀病毒实验：将不同浓度小檗碱（20–160 µM）或大黄素（0.04–40 µM）与 10⁶ PFU/mL 的寨卡病毒在 37 °C 下共孵育 1 小时，同时设置仅含药物稀释液（DMEM + 0.1% DMSO）的对照组。随后将药物处理后的病毒上清液接种于 Vero E6 细胞进行空斑滴定，培养 96 小时后用 10% 甲醛固定并用结晶紫染色，统计病灶数量以评价病毒感染力的变化。第三步是细胞预治疗实验：为了检测化合物是否通过影响细胞受体而干扰病毒进入，Vero E6 细胞先用 160 µM 小檗碱或 40 µM 大黄素预处理 1 小时，洗涤去除药物后再感染寨卡病毒，培养 96 小时后统计病灶数并与未处理对照组比较。第四步是选择指数（selectivity index, SI）计算：通过非线性回归分别计算半数抑制浓度（IC₅₀）和半数细胞毒性浓度（CC₅₀），以 CC₅₀/IC₅₀ 作为选择指数。第五步是动态光散射（dynamic light scattering, DLS）分析：将纯化的寨卡病毒颗粒在 37 °C 条件下分别与 40 µM 大黄素或 160 µM 小檗碱孵育 1 小时，使用 Zetasizer Nano S90 仪器以 632.8 nm 氦氖激光在 90° 散射角进行检测，每次检测采集 30 次、每次 30 秒，用 Zetasizer 软件分析病毒颗粒的流体力学半径（hydrodynamic radius）变化。在统计方面，病毒抑制结果以相对于阴性对照（培养基加药物稀释液）的百分比表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey 事后检验，使用 GraphPad Prism 5.0 软件进行分析。

在主要结果方面，细胞毒性实验显示，小檗碱和大黄素在 Vero E6 细胞中均表现出较低毒性。小檗碱的最高无毒浓度为 160 µM，大黄素的最高无毒浓度为 40 µM，在这些浓度下细胞活力超过 80%。经非线性回归计算，小檗碱的 CC₅₀ 为 221 µM，大黄素的 CC₅₀ 为 68.6 µM。杀病毒实验结果表明，两种化合物均能以剂量依赖方式显著降低寨卡病毒的感染性。当寨卡病毒与 160 µM 小檗碱孵育后，空斑数从对照组的 7.6 × 10³ PFU/mL 降至 1.7 × 10³ PFU/mL，病毒感染力下降 77.6%；与 40 µM 大黄素孵育后，空斑数从 7.8 × 10³ PFU/mL 降至 1.3 × 10³ PFU/mL，感染力下降约 83.3%。小檗碱在不同浓度下均能显著减少病灶数，而大黄素除 0.04 µM 这一最低浓度外，其余浓度均表现出显著抑制作用。据此计算得到小檗碱的 IC₅₀ 为 39.06 µM，选择指数为 5.65；大黄素的 IC₅₀ 为 3.2 µM，选择指数为 21.44，提示大黄素在体外具有更好的选择性和安全性窗口。细胞预治疗实验结果显示，小檗碱预处理对寨卡病毒进入细胞没有影响；而大黄素预处理使病毒进入减少 42.3%，空斑数从对照组的 3 × 10⁴ PFU/mL 降至 1.73 × 10⁴ PFU/mL，说明大黄素还可能通过作用于宿主细胞膜或病毒进入环节而部分抑制感染。动态光散射实验为两种化合物的直接杀病毒机制提供了重要物理证据。纯化寨卡病毒颗粒在溶液中呈单分散状态，加入 40 µM 大黄素或 160 µM 小檗碱后，病毒样品的流体力学半径均显著减小。由于流体力学半径反映的是包含水化层在内的颗粒表观尺寸，该结果表明两种化合物可能诱导病毒包膜磷脂双分子层发生紊乱或破坏，或改变病毒颗粒在溶液中的溶剂化特性。大黄素处理后的寨卡病毒粒径分布峰更窄，提示其作用后病毒颗粒状态更为均一。单独加入相同浓度 DMSO 作为对照时，病毒粒径未发生显著变化，排除了溶剂干扰。

综合这些结果，本研究得出结论：小檗碱和大黄素在体外对寨卡病毒具有强烈的直接杀病毒作用。这种作用主要表现为两种化合物与病毒颗粒共孵育后显著降低其感染性，并通过动态光散射证实病毒颗粒流体力学半径发生改变，从而提示病毒包膜结构可能受到破坏。值得注意的是，大黄素还表现出一定的细胞预治疗抑制效果，说明其可能兼具直接灭活病毒和干扰病毒进入的双重机制。小檗碱尽管对病毒进入无预防作用，但其直接灭活效应仍然显著。由于小檗碱和大黄素在有效浓度下表现出高细胞活力，即具有较好的安全性窗口，因此这两种天然产物可作为治疗寨卡病毒感染的候选药物，也有可能在低剂量下用于地方性流行区的预防性干预。小檗碱在体内可分布于肝脏、肾脏、肌肉和脑等多个器官，并能维持较长时间，这对抑制寨卡病毒在多组织中的感染具有潜在优势。此外，小檗碱在人类中应用时毒性较低，无严重不良反应。尽管这类化合物存在水溶性差和体内代谢较快等药物开发障碍，但近年来已有多种基于脂质纳米载体等策略的递送系统被报道用于改善小檗碱和大黄素的体内药代动力学性质。

本研究的亮点在于，首次系统证明了小檗碱和大黄素对寨卡病毒颗粒的直接杀病毒作用，而不只是抑制病毒复制或进入。动态光散射技术在本研究中的应用也具有特别价值，它从物理化学角度为病毒包膜结构受到破坏提供了直接测量数据，弥补了传统病毒学实验仅从感染性变化推断机制的不足。此外，研究同时评估了两种结构类型不同但均来源于药用植物的天然化合物，为从天然产物库中筛选抗寨卡病毒药物提供了新思路。研究设计还区分了“直接灭活病毒”和“作用于宿主细胞”的不同干预模式，从而更清晰地揭示了两种化合物的作用特点。尤其是大黄素选择指数达到 21.44，表现出良好的体外成药潜力。该研究为今后进一步开展动物实验和临床前研究奠定了实验基础，也为在寨卡病毒流行地区利用天然来源化合物进行预防和治疗提供了科学依据。