学术综述报告

这篇论文名为《A First-in-Class Pyrazole-Isoxazole Enhanced Antifungal Activity of Voriconazole: Synergy Studies in an Azole-Resistant Candida Albicans Strain, Computational Investigation and in Vivo Validation in a Galleria Mellonella Fungal Infection Model》，发表于国际期刊 *Journal of Medicinal Chemistry*，2024年第67卷14256-14276页，发表日期为2024年8月8日，作为该期刊“Fungal Pathogens-Life Cycle, Infection, Host Immunity, and Drug Discovery”特刊的一部分。这项研究主要作者包括 Sveva Pelliccia、Pasquale Russomanno、Simona Barone 和 Baptiste Mateu 等人，主要机构涉及多个国际科研单位。

学术背景

本研究的科学领域聚焦于抗真菌药物的发现与开发背景，特别是对侵袭性真菌疾病（Invasive Fungal Diseases, IFDs）的治疗。其中，白色念珠菌（Candida albicans）因其在侵袭性真菌感染中的关键作用而成为优先研究对象。随着唑类抗真菌药物的广泛使用及部分不当使用，该类真菌的耐药性显著增强，尤其对于免疫功能受损的群体——如HIV感染者、器官移植患者及癌症患者——其耐药菌株的发病率和死亡率仍居高不下（20%-50%）。

尽管现有抗真菌药物（如两性霉素B（Amphotericin B）、唑类药物（如伏立康唑，Voriconazole）和棘白菌素类（如Caspofungin））在治疗系统性真菌感染方面表现出较高疗效，但长时间使用常带来较严重的毒副作用。此外，耐药性的发生仍是这一领域的主要挑战。因此，寻找能够显著提高药效的新型化学实体或者能够增强现有抗真菌药物联合作用的分子组合，是当前研究的核心目标。

研究目标

本研究旨在发现一种新型化学实体，能够与伏立康唑联合使用，对抗唑类耐药的白色念珠菌菌株（Candida albicans ATCC 10231）。研究者希望通过实验验证这种化合物的协同抗真菌活性，并揭示其分子机制，同时开展毒理学与生物相容性研究，为进一步优化该化合物作为抗真菌联合治疗的候选药物奠定基础。

研究详细过程

本研究分为以下几个主要步骤：

1. 化学合成与化合物筛选：
   研究者设计并合成了一系列含有吡唑（Pyrazole）和异噁唑（Isoxazole）骨架的新化合物，其合成路线详见论文。核心化合物SL38（编号5b）以含有特定结构修饰的吡唑衍生物为基础，引入异噁唑基团。该化合物的纯度通过高效液相和核磁共振波谱技术表征。

2. 体外抗真菌活性评估：
   使用标准微量稀释法测试所有化合物对白色念珠菌ATCC 90028和唑类多药耐药菌株ATCC 10231的抗真菌活性。单独使用5b时，其最低抑菌浓度（MIC）大于200μM，抗真菌活性非常弱。然而，在与伏立康唑联合使用时，通过checkerboard交叉实验发现该组合显示显著的协同效应，其分数抑制浓度指数（FICI）为0.254，表明其协同作用可以大幅降低伏立康唑的有效抑菌浓度。

3. 评估药物对真菌形态学的影响：
   研究表明，白色念珠菌的致病性与其从单细胞酵母型向多细胞菌丝型的转化密切相关。在培养基中添加血清以诱导菌丝生长后，加入化合物5b和伏立康唑的组合发现，菌丝的延长显著抑制，大多数真菌维持酵母形态。这提示化合物5b不仅能抑制真菌生长，还可能降低其侵袭性。

4. 分子机制研究：
   研究者利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，化合物5b能够显著下调白色念珠菌Erg11基因（编码CYP51, Lanosterol 14α-demethylase）的表达。而伏立康唑单独使用时该基因上调。分子对接实验进一步揭示了5b与伏立康唑联合作用时，能够完整占据CYP51的酶活性位点，包括底物入口通道（SEC）、卟啉环活性位点以及产物出口通道（PPEC），从而增强对酶的抑制作用。

5. 体内实验验证：
   使用蜡蛾幼虫（Galleria mellonella）模型探讨5b的体内毒性和疗效。实验发现，单独使用5b对幼虫未表现出显著毒性，但联合伏立康唑（0.5 mg/ml伏立康唑+50 μM 5b）处理感染白色念珠菌的幼虫后，其存活率显著高于对照组，指出该组合在体内具有明显的协同效应。

6. 生物相容性评估：
   利用人角质形成细胞（HaCaT细胞系），研究发现化合物5b在低浓度（≤25μM）下具有良好的生物相容性。高浓度（>50 μM）和较长处理时间（96小时）可能产生一定的细胞毒性。

7. 体外酶活测定及ADMET分析：
   化合物5b显著增强伏立康唑对CYP51的酶活性抑制作用。ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）预测显示，5b的胃肠道吸收能力和溶解性优于现有的抗真菌药物，如伏立康唑和伊曲康唑。

研究主要结果

1. 化合物5b单独使用时抗真菌活性较弱，但与伏立康唑联合使用表现出显著的协同作用。
2. 体外实验显示该组合能够显著抑制真菌生长及酵母到菌丝的形态转变。
3. 分子对接分析揭示了化合物5b协同作用的分子机制。
4. 体内实验证明化合物联合伏立康唑可显著提高白色念珠菌感染模型中的生存率。
5. 化合物5b在合适浓度范围内表现出良好的生物相容性。

研究结论与意义

本研究证明了化合物5b作为伏立康唑的辅药，能够显著改善药物对耐药真菌菌株的疗效。其协同作用的分子机制清晰，且在体内外实验中得以验证，这表明5b有望作为新型抗真菌联合治疗的候选分子。此外，化合物5b具备良好的药代动力学特性，为后续优化和开发提供了重要参考。

研究亮点

1. 发现并验证了一类全新抗真菌协同化合物。
2. 提出了化合物5b联合伏立康唑的全新作用机制。
3. 体内外实验均支持协同疗效，并揭示了其对新病理阶段的抑制能力。
4. 提供了一种具有药物开发潜力的新型分子，通过优化可商业化。

总结

本研究为抗真菌领域内对唑类耐药菌株的联合疗法提供了新的可能性，既丰富了抗真菌药物的研发策略，也拓展了药物与靶点作用的研究范畴。这项成果不仅在学术上具备高价值，还为相关治疗的药物研发指明了方向。