针对猫杯状病毒具有保护作用的抗原筛选与免疫效力评估研究学术报告
本研究由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控国家重点实验室的刘嘉森和曲连东作为共同通讯作者，杨玉鹏和齐瑞彬作为共同第一作者，联合东北农业大学兽医学院的研究人员共同完成。研究成果以题为“Screening and immune efficacy evaluation of antigens with protection against feline calicivirus”的论文形式，于2024年10月24日发表在学术期刊《Vaccines》上。
一、 学术背景 本研究属于兽医学、病毒学及疫苗研发领域，聚焦于猫杯状病毒（Feline Calicivirus, FCV）的防控。FCV是引起猫科动物上呼吸道疾病的最常见病原体之一，主要导致口腔溃疡和多种呼吸道症状，严重时可致死。该病毒属于杯状病毒科水疱病毒属，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，其高突变率导致病毒存在显著的抗原多样性，形成了不同的基因型（如GI和GII）和毒株，这给疫苗防控带来了巨大挑战。
目前，中国FCV的预防和控制主要依赖灭活疫苗，但疫苗种类单一，且现有疫苗（如基于FCV-255株的“妙三多”商业疫苗）对国内流行异源毒株的中和效价相对较低，防控效果不理想。因此，开发具有广谱保护效果的新型疫苗至关重要，而新型疫苗开发的核心在于筛选出能诱导广泛交叉保护性免疫反应的关键抗原表位。FCV的主要抗原蛋白是其衣壳蛋白VP1，该蛋白被分为A到F六个区域，其中C、D、E区的变异会影响病毒的抗原性。先前研究表明，E区是主要抗原表位域，但针对涵盖多个关键区域的更优保护性抗原片段的研究尚不充分。
本研究的目的是：通过对中国FCV分离株进行遗传进化分析，明确流行基因型；以此为基础，筛选并鉴定出具有广谱保护作用的FCV抗原区域；进而构建并评估基于该抗原区域的重组蛋白疫苗的免疫保护效力，为开发新型广谱FCV疫苗奠定理论基础。
二、 详细研究流程 本研究包含一系列逻辑严密的实验步骤，从生物信息学分析到体内外功能验证，最终进行动物攻毒保护实验。
1. 遗传进化分析与抗原设计： 首先，研究人员从GenBank下载了包括中国分离株在内的FCV全基因组核苷酸序列，利用MEGA-X软件进行序列比对并构建最大似然（Maximum Likelihood, ML）系统发育树。分析确认了中国流行的FCV毒株主要分为GI和GII两种基因型，其中GI型为优势基因型。基于前期研究筛选出的具有广谱中和潜力的疫苗候选株DL39（GI型），以及代表GII型的FB-NJ-13株，研究人员针对VP1蛋白的不同区域（B, CD, E, F, B-D, C-E）设计了截短表达引物。这些区域片段通过PCR扩增后，克隆至pET-32a原核表达载体，旨在表达带有TrxA标签和His标签的系列重组蛋白（如B39, CD39, E39, F39, BD39, CE39等）。
2. 重组蛋白的表达、纯化与鉴定： 将构建好的重组质粒转入BL21感受态细胞进行诱导表达。为了获得可溶性好、产量高的蛋白，研究团队对每个重组蛋白的IPTG诱导浓度、表达温度和表达时间进行了单独优化。表达后的菌体经超声破碎，使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹（Western Blot, WB）对纯化蛋白进行分析鉴定。WB实验同时使用了抗His标签抗体和FCV 2280毒株的小鼠抗血清作为一抗，结果证实所有纯化的重组蛋白均具有预期大小和高纯度，且能被FCV特异性抗体识别，表明其保留了FCV的抗原性。
3. 抗原区域的体外筛选： 此阶段采用两种血清学方法筛选最优保护性抗原区域。 * 竞争性ELISA（酶联免疫吸附试验）： 将纯化的各重组蛋白分别与同源病毒（DL39或FB-NJ-13）的猫抗血清预先孵育，然后加入包被了相应同源病毒抗原的ELISA板中。如果重组蛋白能与血清中的抗体结合，则会竞争性抑制血清抗体与板上病毒抗原的结合，导致OD450值降低。结果表明，对于DL39和FB-NJ-13毒株，其CE（即C-D-E）区域蛋白、BD区域蛋白和F区域蛋白均显示出显著的竞争抑制效果，其中CE蛋白的竞争效果最为突出，初步提示这些区域具有较强的免疫反应性。 * 竞争性中和试验： 这是一种更功能性的筛选方法。将系列稀释的重组蛋白与固定稀释度的同源病毒猫抗血清共孵育，然后加入活病毒进行传统中和试验。如果重组蛋白能够“吸附”或“消耗”掉血清中的中和抗体，那么剩余血清中和病毒的能力就会下降，表现为中和率降低（即细胞病变更严重）。中和率越低，说明该蛋白竞争结合中和抗体的能力越强，越可能是关键的保护性抗原表位。结果显示，无论是针对GI型的DL39还是GII型的FB-NJ-13，其CE蛋白（CE39和CEfb）和E蛋白（E39和Efb）均能显著降低同源血清的中和活性，且CE蛋白的效果优于E蛋白。进一步的交叉竞争中和试验表明，CE39和CEfb蛋白不仅能降低同源血清的中和效价，还能有效降低血清对多种其他流行毒株（如HRB48, TIG-1, DL38, 2280）的交叉中和效价，证明了CE区域抗原具有广谱潜力。
4. 二价重组蛋白的构建与表达： 基于上述筛选结果，研究团队将GI型DL39株和GII型FB-NJ-13株的CE片段通过融合PCR技术连接，构建了同时包含两种基因型关键抗原的二价重组蛋白表达质粒，表达出的蛋白命名为CE39-CEfb。该蛋白同样经过表达条件优化、纯化及SDS-PAGE、WB鉴定，确认成功表达。
5. 免疫原性与保护效力体内评估： 这是研究的核心验证部分。研究使用39只2月龄、FCV抗体阴性的中国本土猫，随机分为13组（每组3只）。设置以下免疫组：CE39蛋白免疫组、CE39-CEfb二价蛋白免疫组、商业灭活疫苗“妙三多”（FCV-255株）免疫组（阳性对照）、病毒攻击阳性对照组（只免疫佐剂+攻毒）以及阴性对照组（只免疫佐剂+不攻毒）。所有蛋白免疫均使用Montanide™ Gel佐剂。猫在初次免疫后21天进行加强免疫。 * 交叉中和抗体检测： 在二次免疫后14天采集血清，进行交叉中和试验。结果显示，CE39和CE39-CEfb免疫组血清对国内流行的GI型（HRB48, 2280, TIG-1）和GII型（DL38, FB-NJ-13）毒株均能产生较高的中和抗体滴度（范围分别为1:45至1:15和1:48至1:29），且对部分流行株的中和效价显著高于“妙三多”免疫组。 * 攻毒保护实验： 在采血同日，除阴性对照组外，其余组别分别用三种代表性毒株进行滴鼻攻毒：GI型流行株HRB48、GII型流行株FB-NJ-13、以及高致病性的全身性病毒性疾病（Virulent Systemic Disease, VSD）相关毒株2280（GI型）。攻毒后连续监测临床症状（根据预定的临床评分标准进行打分）、体温、体重、口腔/肛门拭子病毒排放量以及血液中的病毒血症水平。 * 组织病理学检查： 实验结束后，人道处死所有实验猫，取肺组织进行病理学观察和切片检查，评估疫苗对肺部病理损伤的保护效果。
三、 主要研究结果 1. 遗传进化分析结果： 系统发育树清晰显示，中国FCV流行株分为GI和GII两个主要基因型。在分析的61个国内毒株中，GI型占68.9%（42株），GII型占31.1%（19株）。疫苗株F9和强毒株2280均属于GI型。这为后续选择具有代表性的毒株进行抗原筛选和攻毒实验提供了依据。 2. 最优保护性抗原区域鉴定结果： 竞争性ELISA和竞争性中和试验数据一致指向CE（C-D-E）区域。体外实验证实，无论是GI型还是GII型毒株，其VP1蛋白的CE区域重组蛋白（CE39和CEfb）在竞争结合中和抗体方面表现最优，且能广谱地抑制血清对多种不同基因型毒株的中和能力。这首次通过实验证实，FCV不同基因型毒株的最优保护性抗原区域均位于CE区。 3. 二价蛋白的免疫原性结果： 成功构建并表达了CE39-CEfb二价重组蛋白。猫免疫实验表明，该蛋白能诱导产生高水平的交叉中和抗体，其效价与CE39单蛋白免疫组相当或略优，且均优于商业疫苗组。 4. 体内攻毒保护结果： 这是本研究最具说服力的发现。攻毒实验结果显示： * 与病毒攻击阳性对照组相比，CE39和CE39-CEfb免疫组能显著减轻由GI型（HRB48）、GII型（FB-NJ-13）和VSD毒株（2280）攻击引起的临床症状。阳性对照组猫出现了典型的FCV感染症状，包括发热、体重减轻、精神沉郁、呼吸困难、口腔溃疡等，而免疫组猫的症状轻微，且均未出现典型的口腔溃疡。 * 临床评分统计显示，针对三种攻击毒株，两个重组蛋白免疫组的临床评分均极显著低于阳性对照组（p < 0.001），且普遍低于“妙三多”疫苗免疫组，表明重组蛋白提供了更优的免疫保护。 * 在病毒排放和病毒血症方面，重组蛋白免疫组的病毒载量显著低于阳性对照组，尽管病毒排放仍可持续至攻毒后14天，但滴度更低。 * 组织病理学检查进一步证实了保护效果：阳性攻击组的肺组织可见不同程度的出血、充血及肺泡壁增厚等病变；而所有免疫组（包括CE39、CE39-CEfb和“妙三多”组）的猫肺组织均未观察到典型病变，病理切片无明显异常。这表明免疫有效防止了FCV感染引起的肺部病理损伤。
四、 研究结论 本研究通过系统的体内外实验，成功筛选并鉴定出猫杯状病毒VP1蛋白的CE（C-D-E）区域为具有广谱抗原性的关键保护性抗原区域。基于此区域构建的单价（CE39）和双价（CE39-CEfb）重组蛋白疫苗，在猫体实验中显示出对GI型、GII型乃至高致病性VSD毒株攻击的有效保护力，其免疫保护效果优于目前使用的商业灭活疫苗。这初步证明，FCV毒株的最优保护性抗原区域位于CE区。
五、 研究的意义与价值 * 科学价值： 本研究不仅验证了CE区域作为FCV广谱保护性抗原的有效性，更重要的是揭示了不同基因型FCV毒株共享这一关键抗原区域，这为理解FCV的抗原结构和免疫优势区域提供了新的实验证据。研究为开发不依赖于完整病毒颗粒的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗乃至mRNA疫苗等新型疫苗平台提供了明确的目标抗原。 * 应用价值： 针对FCV抗原多样性导致的疫苗保护力不足这一现实问题，本研究提出的基于CE区域的广谱抗原设计策略，为开发新一代具有交叉保护能力的FCV疫苗奠定了坚实的理论基础和技术支持。CE39-CEfb二价蛋白的设计思路，也为应对多基因型共流行的传染病疫苗研发提供了参考。 * 对其他研究的启示： 杯状病毒科成员（如诺如病毒）多数缺乏高效的体外培养系统，且存在众多抗原性不同的基因型，这阻碍了传统疫苗的研发。本研究在FCV中成功筛选广谱保护性抗原表位的方法和结论，可为其他杯状病毒（尤其是诺如病毒）的疫苗抗原设计提供重要的理论借鉴。
六、 研究亮点 1. 研究思路的系统性与创新性： 研究从流行病学分析（基因分型）出发，到抗原表位筛选（体外竞争实验），再到疫苗构建（单价/二价设计）和最终体内效力验证（多毒株攻毒），形成了一个完整且逻辑闭环的疫苗抗原发现与评估体系。 2. 关键抗原区域的精准定位： 首次通过竞争性中和试验这一功能性实验，结合体内攻毒保护实验，综合确定了CE区域是比单独E区更优的广谱保护性抗原区域，结论可靠。 3. 二价抗原设计策略： 基于筛选结果，创新性地构建了包含GI和GII型代表毒株CE区的二价融合蛋白，并验证了其免疫效果，为开发覆盖更广谱毒株的多价疫苗探索了可行路径。 4. 严谨的体内实验设计： 动物实验设计周密，设置了包括商业疫苗在内的多个对照，并采用三种具有代表性的毒株（不同基因型、不同致病类型）进行攻毒，全面评估了候选抗原的保护广度与效力，数据说服力强。 5. 明确的转化医学前景： 研究直接针对现有FCV疫苗的不足，目标明确，所获成果具有直接转化为新型疫苗产品的潜力，应用导向清晰。
七、 其他有价值的讨论 论文在讨论部分也客观指出了本研究的局限性及未来方向：例如，原核表达系统表达的蛋白肽段其高级结构可能与天然病毒颗粒不同，可能导致部分构象表位丢失，这可能是免疫后虽能提供临床保护但未能完全清除病毒排放的原因之一。未来可通过优化CE区氨基酸序列以更好地展示抗原表位、或选用更有效的免疫佐剂和细胞因子来增强免疫应答。此外，研究也提出将生物信息学和结构生物学指导的抗原设计、以及多表位疫苗策略作为进一步优化广谱疫苗的重要方向。这些讨论为后续研究指明了道路。