学术研究报告：一种新型人类卵巢细胞三维模型系统的建立与表征——Silk-Ovarioids
本研究报告由Valentina Di Nisio、Tianyi Li、Pauliina Damdimopoulou及Andres Salumets等学者领导的多国联合研究团队完成，涉及瑞典卡罗林斯卡医学院及附属医院、爱沙尼亚Celvia CC健康技术能力中心、葡萄牙国际伊比利亚纳米技术实验室、丹麦技术大学国家食品研究所等十余所研究机构。该研究成果于2025年7月10日在线发表于牛津大学出版社旗下学术期刊《Human Reproduction Open》（卷号2025，期号3，文章ID hoaf042），是一项在生殖医学与组织工程领域具有突破性的原创性研究。
一、 学术背景
本研究隶属于生殖医学、组织工程与发育生物学交叉领域。女性的生育能力高度依赖于卵巢功能及卵巢储备，即卵巢皮质中处于休眠状态的卵泡池。卵巢储备的耗竭可由年龄、疾病（如早发性卵巢功能不全，POI）或医源性、环境毒性暴露等因素引起。随着癌症治疗技术的发展，年轻癌症幸存者数量增加，由放化疗等引起的医源性卵巢损伤及不孕问题日益突出。目前，为面临高不孕风险的青春期前女孩保存生育力的唯一临床手段是卵巢组织冷冻保存及未来的自体移植。然而，对于存在全身性恶性肿瘤（如白血病）风险的患者，移植组织可能重新引入癌细胞，限制了该技术的应用。因此，开发体外（*in vitro*）卵泡生长和卵母细胞成熟技术成为至关重要的替代策略。
要成功实现体外卵泡发育，一个能够模拟体内卵巢复杂微环境的三维（3D）培养系统是关键。卵巢是一个高度异质性的器官，包含颗粒细胞、间质细胞、内皮细胞、血管周细胞等多种体细胞，它们通过精密的细胞间通讯和细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）网络，共同支持卵泡的激活、生长、激素分泌及血管生成等生理过程。传统的二维（2D）单层细胞培养无法复现这种空间结构和相互作用。现有的3D模型，如基于动物模型的系统、生物打印支架或脱细胞卵巢支架等，普遍存在培养时间短、标准化程度低、难以转化至人类应用、以及内部氧气和营养供应受限（易形成坏死核心）等问题。特别是，利用人类原代卵巢体细胞建立能够长期稳定维持、并保留关键细胞类型和功能的3D模型，仍是一个未解决的挑战。因此，本研究旨在探索并建立一种能够长期培养人类原代卵巢体细胞的稳健3D模型系统，以促进对卵巢生物学、疾病机制、毒性测试以及未来构建“人工卵巢”的研究。
二、 研究详细流程
本研究设计严谨，流程环环相扣，主要包含以下几个核心步骤：
1. 组织样本获取与细胞制备： - 研究对象： 研究获得了瑞典斯德哥尔摩地区伦理审查委员会的批准。卵巢组织样本来源于5名接受性别肯定手术的成年患者（平均年龄26±5岁），所有参与者均签署了知情同意书。 - 样本处理： 手术当天，获取的卵巢组织立即转运至实验室。首先将卵巢皮质（Cortex）与髓质（Medulla）分离。随后，采用机械结合酶消化的方法（使用胶原酶IA、Liberase™和DNA酶I），将皮质和髓质组织分别消化成单细胞悬液。 - 对照设置： 从每位患者的皮质和髓质分离的细胞中，取出一部分进行标准的2D单层培养，作为整个实验过程的平行对照。
2. 三种3D培养系统的构建与初步筛选： 研究者测试了三种不同的3D培养策略，使用来自同一样本的细胞进行平行比较： - 无基质卵巢球体（Matrix-Free Ovarian Spheroids， MFOS）： 将不同密度的细胞接种在超低吸附96孔板中，依靠细胞自聚集形成球体。此方法无需外源性支架。 - 基于基质胶的三层梯度系统（Matrigel-based Three-Layer Gradient System， 3LGS）： 参照已发表的方法，在悬滴培养皿中，将细胞包裹在Matrigel中形成三层梯度结构的微球。 - 基于生物丝（Biosilk）的支架系统——Silk-Ovarioids： 这是本研究开发的核心方法。使用由重组蛛丝蛋白（spindroins）功能化修饰（含RGD序列）制成的Biosilk™蛋白溶液，通过吹打形成多孔泡沫状支架。将单细胞悬液（每个支架1.2×10^5个细胞）接种到泡沫中，混合均匀。初始2周，细胞-丝蛋白复合体贴壁培养，之后将接种好的泡沫提起并分割成两半（即形成单个Silk-Ovarioid），转移至超低吸附平板中进行悬浮培养，总培养时间长达42天。整个培养过程中，每两天更换一半培养基。
3. 模型表征与深入分析： 在对三种模型进行初步培养观察后，确认MFOS和3LGS系统无法维持长期培养（分别最多15天和11天），而Silk-Ovarioids系统成功形成了稳定的三维聚集体。因此，后续所有深入分析均聚焦于Silk-Ovarioids模型及其对照。 - 形态学与细胞活力评估： 通过相差显微镜和石蜡切片苏木精-伊红（H&E）染色观察结构形态；使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法、γ-H2A.X和Cleaved Caspase 3免疫荧光染色检测细胞凋亡与DNA损伤；使用Ki67免疫荧光染色评估细胞增殖。 - 转录组学分析（RNA测序）： 培养42天后，收集新鲜的卵巢组织、2D培养细胞以及Silk-Ovarioids样本，提取RNA进行RNA测序（RNA-seq）。数据分析包括：主成分分析（PCA）、差异表达基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）鉴定（标准：错误发现率FDR<0.05，log2倍数变化>2，平均表达量>100）、基因集富集分析（GSEA）、基因本体论（GO）分析。特别关注了细胞周期、缺氧、血管生成、类固醇生成等相关通路。此外，利用已发表的卵巢单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据作为参考，通过“阻尼加权最小二乘法”（Dampened Weighted Least Squares, DWLS）对Silk-Ovarioids的RNA-seq数据进行细胞类型反卷积分析，以推断其细胞组成。 - 蛋白质组学分析： 对新鲜组织和Silk-Ovarioids样本进行基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学分析，使用TMT-10plex标记进行定量。分析了与缺氧、血管生成、ECM相关蛋白的表达水平，并与转录组数据进行了相关性分析。 - 关键标记物的空间定位验证： 为了在空间层面验证转录组和蛋白质组的发现，研究采用了多种原位技术： * RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）： 在Silk-Ovarioids石蜡切片上检测了AMHR2（颗粒细胞）、PDGFRA（间质细胞）、CLDN5（内皮细胞）、GJA4/CX37（血管周细胞）的mRNA表达。 * 免疫荧光染色（Immunofluorescence）： 检测了上述细胞类型标记物（如GPIHBP1、MCAM）的蛋白表达，以及缺氧相关蛋白（MMP2, PDGFRβ）、血管生成相关蛋白（TGFBR2, BMP2, PDGFα）、ECM蛋白（COL1α1, LAMA1）的定位。 - 功能学分析——细胞因子与类固醇激素分泌检测： * 细胞因子阵列： 使用Luminex多重免疫检测平台，对培养42天后的Silk-Ovarioids培养基上清进行34种细胞因子/趋化因子的定量分析。 * 类固醇激素检测： 使用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）对同一上清样本中的15种类固醇激素进行高灵敏度定量。
三、 主要研究结果
1. 三维模型筛选结果： MFOS和3LGS系统均告失败，无法形成可长期维持的聚集体。相反，Silk-Ovarioids系统取得了全面成功。来自5位患者的皮质和髓质细胞均能在Biosilk支架上稳定生长，形成直径400-1000 μm的致密三维结构，并可在悬浮状态下稳定培养长达42天以上（后续实验甚至延长至168天）。H&E染色显示整个结构内细胞分布完整，无明显的坏死核心。TUNEL、γ-H2A.X和Cleaved Caspase 3染色均为阴性，证实细胞死亡率极低。Ki67阳性细胞主要分布在结构的外层，表明存在可控的增殖活动。
2. Silk-Ovarioids保留了卵巢主要体细胞类型： 基于scRNA-seq参考数据的反卷积分析预测，Silk-Ovarioids中包含间质细胞（主要群体）、血管周细胞、颗粒细胞和内皮细胞。这是本研究的一个关键发现：内皮细胞仅在Silk-Ovarioids中被检测到，而在2D培养中缺失。 RNA-FISH和免疫荧光染色在蛋白和mRNA水平上成功验证了这些细胞类型的存在：PDGFRα（间质细胞）、AMHR2（稀疏的颗粒细胞）、CLDN5和GPIHBP1（内皮细胞）、GJA4/CX37和MCAM（血管周细胞）。重要的是，在培养6周后的皮质来源Silk-Ovarioids核心，观察到了CLDN5和GPIHBP1阳性的管状结构，提示发生了新生血管样结构（de novo angiogenesis）的形成。
3. 转录组学揭示独特的缺氧-血管生成激活特征： PCA显示培养样本（2D和3D）与新鲜组织存在显著差异，这反映了体外培养环境的系统性影响。与2D培养相比，Silk-Ovarioids显示出更高的细胞周期相关基因（G2M/S期）表达。GSEA分析表明，无论是2D还是3D培养，都上调了缺氧和血管生成相关通路。然而，进一步深入分析发现了两者的本质区别： - 2D培养：上调的缺氧相关基因富集于氧化应激和活性氧代谢等压力响应通路。 - Silk-Ovarioids：上调的缺氧相关基因则富集于调节内皮管腔大小、血管直径维持等与血管生成直接相关的通路。同样，血管生成相关基因在Silk-Ovarioids中特异性富集于“内皮细胞分化”、“血管内皮细胞迁移调控”和“出芽血管生成”等过程。这表明，Silk-Ovarioids中的缺氧环境并非导致细胞损伤，而是驱动了一个促血管生成的程序。
4. 蛋白质组学与空间定位验证缺氧诱导的血管生成过程： 蛋白质组数据与转录组数据呈中度至强相关，验证了分子层面的发现。免疫荧光染色生动地展示了这一动态过程：在尚未形成明显血管的髓质来源Silk-Ovarioids核心，缺氧标记物（MMP2, PDGFRβ）高表达，形成一个促血管生成的缺氧核心。在这个核心周围，可以检测到血管生成标记物（TGFBR2, BMP2, PDGFα）的微弱表达。而在已形成血管样结构的皮质来源Silk-Ovarioids中，血管生成标记物在管状结构上强烈共定位，而核心区域的缺氧标记物信号减弱。这清晰地表明，Silk-Ovarioids内部自发形成了一个 “缺氧核心→激活血管生成信号→形成新生血管→改善局部氧供→缺氧信号减弱”的动态反馈调节机制。
5. 细胞外基质（ECM）的分泌与重塑： 与新鲜组织和2D培养相比，Silk-Ovarioids中ECM相关基因（如COL1A1, LAMA1）显著上调。免疫荧光染色证实了胶原蛋白1α1（COL1α1）和层粘连蛋白α1（LAMA1）在Silk-Ovarioids内部的从头合成与沉积。这证明细胞不仅存活，而且主动重塑并构建了自己的细胞外微环境，这是实现功能性组织模拟的关键一步。
6. 功能性分泌活性： Luminex检测显示，Silk-Ovarioids向培养基中分泌了多种促血管生成的细胞因子，其中以IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP-1, CXCL1和SDF-1α最为丰富。这些因子已知能刺激内皮细胞增殖和迁移，为观察到的血管生成现象提供了功能佐证。LC-MS/MS检测在培养基中检出了低水平的类固醇激素，主要是孕烯醇酮（pregnenolone）和表睾酮（epitestosterone），尽管雌激素水平极低。转录组分析也显示，虽然经典颗粒细胞标记物表达下调，但一些类固醇生成相关基因（如CYP19A1, CYP11A1）和核受体基因在Silk-Ovarioids中表达上调。这证明了Silk-Ovarioids具备一定的内分泌活性潜能。
四、 结论与意义
本研究成功建立并全面表征了一种名为 “Silk-Ovarioids” 的新型、稳健、可长期培养的人类原代卵巢体细胞3D模型系统。该模型利用生物相容性的Biosilk支架，能够支持来自成人卵巢皮质和髓质的多种体细胞（包括间质细胞、内皮细胞、血管周细胞和少量颗粒细胞）共同生长超过6周，并展现出以下核心功能特性：1）自发形成促血管生成的缺氧微环境；2）驱动新生血管样结构的形成；3）主动分泌并重塑细胞外基质；4）分泌促血管生成细胞因子及低水平类固醇激素。
科学价值与应用前景： 1. 作为基础研究平台： Silk-Ovarioids为研究人类卵巢体细胞生物学、细胞间互作、缺氧与血管生成在卵巢中的生理/病理作用、以及卵巢毒性测试（药物、环境毒素）提供了首个长期、稳定且包含关键细胞类型的体外模型。 2. 作为“人工卵巢”的基石： 其低批次差异性和长期稳定性，使其成为未来构建患者特异性、生物工程化人工卵巢的关键一步。该模型本身即可作为一个“生物支架”，有望用于支持体外卵泡生长和卵母细胞成熟研究。 3. 首个卵巢血管生成体外模型： 本研究首次在体外复现了卵巢中由缺氧驱动的新生血管形成过程，为研究卵巢血管疾病、肿瘤血管生成等提供了独特工具。 4. 技术创新价值： 证明了Biosilk这一无动物源性、临床兼容性好的材料在复杂人类原代细胞3D培养中的卓越性能，为其他器官模型的构建提供了新思路。
五、 研究亮点
六、 局限性
作者也指出了本研究的局限性：样本来源于接受雄激素治疗的患者，可能影响细胞行为；培养体系中使用了胎牛血清，且未添加可能对模拟原始组织至关重要的特定生长因子或补充剂。这些为未来研究的优化指明了方向。尽管如此，Silk-Ovarioids模型的建立无疑是人类卵巢体外建模领域的一个重要里程碑，为推进生殖健康研究、个性化医疗和新型生育力保护策略的开发开辟了新的道路。