本研究由Marwa Rejeb、Aida Lahmar、Mohamed Bayrem Ghedira、Arem Selmi、Tahsine Kosksi、Nawres Debbabi及Leila Chekir Ghedira等人完成，通讯作者为Aida Lahmar。研究团队隶属于突尼斯莫纳斯提尔大学牙科医学院生物活性天然产物与生物技术实验室（LR24ES14）。该研究发表于Elsevier旗下期刊《Tissue and Cell》第93卷（2025年），论文编号为102762，于2024年11月8日投稿，2025年1月1日修回，2025年1月25日接收，2025年1月30日在线发表。
皮肤伤口愈合是一个涉及止血、炎症、增殖和重塑等多个阶段的复杂调控过程。在增殖阶段，细胞增殖、粘附和迁移是修复创面的关键事件。真皮细胞通过合成并与其所处的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相互作用来维持结构完整性并促进健康功能。胶原蛋白是ECM中最丰富的蛋白质，占皮肤干重的70%至80%，为真皮提供机械和结构完整性，同时参与细胞粘附与迁移等关键生物学过程。然而，在伤口损伤过程中胶原蛋白的稳定性受到挑战。天然来源尤其是植物提取物被证实可以促进伤口愈合并与胶原蛋白相互作用以增强其功效。在此背景下，本研究旨在探究从鱼皮和牛皮肤中提取的胶原蛋白对经植物提取物预处理后的皮肤细胞增殖、迁移和粘附的调控作用，并评估其潜在的协同效应。
研究所选用的两种植物分别为黄连木/乳香黄连木（Pistacia lentiscus，PL，取其叶片）和金盏花（Calendula officinalis，分别取其叶片FL和花FS）。这两种植物在地中海地区广泛生长，具有显著的愈合、抗菌、抗真菌、抗氧化和抗炎等多种生物活性。研究者希望通过将鱼源胶原蛋白（fish collagen, CF）或牛源胶原蛋白（bovine collagen, CB）与这些天然伤口愈合草药提取物相结合，为优化复合材料以增强细胞愈合能力提供理论依据。研究通过皮肤细胞迁移、粘附、活性氧（reactive oxygen species, ROS）抑制和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）调控等指标来评估伤口愈合活性。
本研究共包含多个实验程序，涵盖了从材料制备、化学表征到细胞功能评价的完整链条。
第一，胶原蛋白的提取。 采用酸溶法从鱼皮（学名为Schyliorhinus canicula）和牛皮肤中提取胶原蛋白。将10克皮肤材料切碎后，以1:10（重量/体积）比例与0.1%氢氧化钠（NaOH）溶液混合，鱼皮在4°C下搅拌24小时，牛皮肤则预处理过夜后再搅拌6小时。为去除脂肪，牛皮肤在丁醇中浸泡18小时。样品经蒸馏水洗涤三次后，用0.5%乙酸溶液在4°C下处理43小时。随后加入2.5 M氯化钠（NaCl）使胶原蛋白沉淀，以5000 rpm离心30分钟，沉淀物冷冻干燥后于-20°C保存。
第二，植物材料的制备与醇提取。 黄连木叶片和金盏花地上部分分别采集自突尼斯纳布勒和莫纳斯提尔地区。植物材料经干燥研磨成粉末后，取100克干燥植物粉末在1升80%乙醇和20%水的混合溶剂中室温浸渍72小时。过滤后的滤液在40°C下减压旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥获得三种不同的水醇提取物：黄连木叶提取物（PL）、金盏花叶提取物（FL）和金盏花提取物（FS）。
第三，酚类化合物的定量。 采用Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚含量（total polyphenol content, TPC），以没食子酸为标准品；采用亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠显色法在510 nm处测定总黄酮含量（total flavonoid content, TFC），以槲皮素为标准品；采用Folin-Denis试剂法在760 nm处测定单宁含量（total tannin content, TTC），以单宁酸为当量计算。
第四，DPPH自由基清除活性测定。 将各提取物以80%乙醇连续稀释至0.015–2 mg/ml的不同浓度，与40 μg/ml的DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼基）溶液等体积混合，室温避光反应30分钟后在570 nm处测定吸光度，以Trolox为阳性对照，计算半数抑制浓度（IC50）。
第五，细胞培养。 使用小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1和人永生化角质形成细胞系HaCaT。细胞在含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。
第六，细胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity, CAA）测定。 使用非荧光探针2,7-二乙酰二氯荧光素（DCFH-DA）评估细胞内ROS水平。3T3-L1和HaCaT细胞接种于96孔黑色微孔板中，以25和12.5 μg/ml浓度的胶原蛋白和水醇提取物（PL、FL、FS）处理24小时。每孔加入5 μl的25 μM DCFH-DA后孵育1小时，然后使用偶氮引发剂ABAP（2,2-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐）诱导氧化应激。用荧光酶标仪在538 nm发射波长和485 nm激发波长下每5分钟监测荧光强度，持续30分钟，以荧光-时间曲线下面积（area under the curve, AUC）估算ROS水平。
第七，细胞迁移实验——划痕法。 将3T3-L1细胞以每孔4×10⁵个细胞接种培养至100%融合形成单层，用无菌移液枪头在细胞层上制造划痕。洗涤去除漂浮细胞后，以25和12.5 μg/ml浓度的胶原蛋白溶液和植物提取物处理。在划痕后即刻（t=0）、16小时和24小时采集图像，使用ImageJ软件测量划痕面积。细胞迁移以表面恢复百分比表示，计算公式为：(A(t0) - A(t16/24)) / A(t0) × 100%。
第八，细胞迁移实验——Boyden室趋触性（haptotaxis）测定。 使用孔径为8.0 μm的聚酯多孔膜Transwell®小室。下室加入150 μl粘附缓冲液，膜上预先包被10 μg/ml的提取胶原蛋白溶液2小时。上室加入100 μl经不同浓度植物提取物预处理24小时的3T3-L1细胞悬液（每孔60,000个细胞），孵育24小时后固定迁移细胞，在600 nm处测定吸光度，以测试组与对照组吸光度之比计算迁移百分比。
第九，细胞粘附实验。 参照Rigot等人（1998）的方法，将3T3-L1细胞悬液在室温下以不同浓度植物提取物处理30分钟。随后将处理后的细胞接种至预先包被CF、CB溶液（10 μg/ml）或多聚-L-赖氨酸（50 μg/ml）的96孔板中，在37°C下粘附1小时。洗去未粘附细胞后，以0.1%结晶紫染色粘附细胞，再用1% SDS裂解，在600 nm处读取吸光度，以测试组与对照组吸光度之比计算粘附百分比。
第十，RNA提取与经典RT-PCR。 使用TRIzol提取HaCaT细胞总RNA，以2 μg总RNA为模板合成cDNA。使用针对MMP-9、MMP-2和β-肌动蛋白（β-actin）基因的特异性引物进行PCR扩增，β-actin作为内参基因用于样本间比较。
第十一，统计分析。 所有实验数据以至少三次独立实验的均值±标准误（SEM）表示。使用GraphPad Prism® 8.4.2软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett事后比较检验，p<0.05认为具有统计学显著性。
植物提取物的化学表征结果。 没食子酸标准曲线测定显示，PL提取物含有显著较高水平的总酚类化合物和类黄酮，分别为396.85 mg GAE/g干提取物和381.7 mg QE/g干提取物。FS的多酚和类黄酮含量（64.41 mg GAE/g和227.2 mg QE/g）高于FL（27.87±4.20 mg GAE/g和30.54±0.78 mg QE/g）。单宁含量以PL最高（5.30 mg/100 g单宁酸当量），其次为FL和FS（约4 mg/100 g）。
DPPH自由基清除活性。 PL表现出相对于Trolox较强的抗自由基活性，IC50值为0.045 mg/ml，显著优于FL（0.77 mg/ml）和FS（1.5 mg/ml）。该结果表明黄连木提取物具有突出的自由基清除能力，与其高含量的酚类化合物一致。
细胞抗氧化活性。 在3T3-L1和HaCaT两种皮肤细胞中，PL、FL和FS均表现出较强的抗氧化特性。PL在清除ABAP诱导的自由基方面尤为高效，以剂量依赖性方式阻止ABAP诱导的DCFH氧化，表明其能有效降低皮肤细胞内的氧化应激水平。
划痕法细胞迁移结果。 成纤维细胞在处理组中随时间推移表现出有效的划痕表面迁移。处理16小时后，不同植物提取物和胶原蛋白处理组的划痕面积显著减少。至24小时，各处理组的划痕几乎完全闭合。经PL、FL和FS提取物处理的成纤维细胞迁移率显著高于未处理细胞，总迁移百分比在63%至94%之间。鱼源胶原蛋白在16小时即表现出比牛源胶原蛋白更强的促迁移效果。24小时后，所有植物提取物和胶原蛋白处理组的成纤维细胞均完全覆盖裸露区域，迁移百分比接近100%，而未处理细胞仅为84%。金盏花花提取物在16小时即显著促进3T3-L1成纤维细胞迁移，而黄连木叶和金盏花叶提取物则在24小时或更长时间后才表现出明显效果。鱼源胶原蛋白呈剂量依赖性且早在16小时即发挥促迁移作用。
Boyden室趋触性迁移结果。 金盏花叶和花提取物处理细胞的迁移率与对照组无显著差异。然而，黄连木提取物处理细胞呈剂量依赖性显著增强迁移。此外，CF和CB均提供了有效的细胞基质，当细胞经植物提取物预处理后，这些基质创造了支持性环境，显著增强了细胞迁移。
细胞粘附实验结果。 从最初的16小时开始，经植物提取物处理的细胞粘附到胶原蛋白包被板上的数量显著高于未处理细胞。在胶原蛋白基质中，CF比CB更有效。黄连木提取物以剂量依赖性方式增加细胞对牛源和鱼源胶原蛋白的粘附，3T3-L1细胞对CF和CB的粘附百分比分别达160%和140%。然而，金盏花水醇提取物并未显著改善成纤维细胞对胶原蛋白溶液的粘附。此外，各提取物对细胞在多聚-L-赖氨酸上的粘附无影响——多聚-L-赖氨酸是一种不依赖整合素的粘附底物——这一结果提示植物提取物很可能通过影响整合素粘附受体家族来发挥作用。
MMP-2和MMP-9表达调控结果。 RT-PCR分析显示，在HaCaT细胞中，CF、CB和FL处理组的MMP-9表达显著升高，而PL和FS提取物处理组的MMP-9表达较未处理细胞下降。同时，不同植物提取物和两种胶原蛋白处理组的MMP-2表达均较未处理细胞明显降低。这些结果表明，提取物和胶原蛋白的组合能够差异性调控两种关键明胶酶的表达，从而影响ECM重塑过程。
本研究证实了提取的鱼源和牛源胶原蛋白与天然植物提取物（黄连木和金盏花）联合使用在促进细胞伤口愈合过程中的潜力。两种胶原蛋白均能作为有效的细胞基质，其与植物提取物的结合为细胞迁移创造了有利的微环境。当胶原蛋白与植物提取物联合使用时观察到显著的协同效应，尤其是在改善成纤维细胞粘附方面。此外，这些组合能有效调控MMP-2和MMP-9的表达。植物提取物尤其是黄连木在减少ABAP诱导的细胞氧化方面表现出高效性。在应用价值方面，基于胶原蛋白、黄连木和金盏花提取物的复合敷料有望在未来开发用于组织再生的新型创面修复材料，为临床伤口管理提供具有抗炎、抗氧化和促愈合多重功能的生物材料策略。
本研究的突出发现包括：第一，系统比较了鱼源和牛源胶原蛋白对皮肤细胞行为的差异影响，证明鱼源胶原蛋白在促进迁移和粘附方面优于牛源胶原蛋白；第二，揭示了黄连木提取物以一种整合素依赖性方式显著增强细胞对胶原蛋白基质的粘附，而金盏花提取物则未表现出类似的粘附增强效应；第三，阐明了不同植物提取物与胶原蛋白组合对MMP-2和MMP-9的差异调控模式——CF、CB和FL上调MMP-9而PL和FS则下调MMP-9，同时所有处理均下调MMP-2——这为理解这些天然材料参与ECM重塑的分子机制提供了新线索。在方法学上，研究将划痕实验与Boyden室趋触性实验相结合，从二维平面迁移和三维基质趋化两个维度综合评价细胞迁移能力，这种多维度功能评价策略增强了对伤口愈合关键细胞行为的把握深度。