该文档发表于《The American Journal of Human Genetics》期刊，2018年12月6日，第103卷第1022-1029页。研究主要由Gemma L. Carvill（西北大学范伯格医学院）、Krysta L. Engel（HudsonAlpha生物技术研究所）等15位并列通讯/共同贡献作者领衔，联合了包括北美、欧洲和澳大利亚多所研究机构及EuroEPINOMICS罕见癫痫综合征、肌阵挛-失张力癫痫和Dravet综合征工作组在内的庞大团队共同完成。这是一项关于SCN1A基因非编码区变异如何导致Dravet综合征及相关癫痫的原创性研究。
本研究隶属于人类遗传学与神经病学交叉领域，专注于发育性癫痫性脑病（Developmental and Epileptic Encephalopathies, DEEs），特别是Dravet综合征（Dravet syndrome, DS）的病因学探索。SCN1A基因编码神经元电压门控钠离子通道的α1亚基，其功能丧失性变异是DS（>80%病例）和其他DEEs的主要遗传病因。然而，通过外显子组测序（Exome Sequencing, ES）等方法，仍有约50%的DEE患者未找到致病遗传变异，提示病因可能隐藏在占基因组98%的非编码区域。本研究旨在验证一个假设：部分未确诊的DEE，特别是DS患者，其致病变异可能位于SCN1A基因未被常规测序覆盖的非编码调控区域。具体研究目标包括：1）在大量未确诊DEE患者中对SCN1A特定的非编码候选区域进行靶向重测序；2）鉴定并统计其中可能致病的罕见变异；3）通过功能实验验证这些变异对基因功能的影响，并阐明其致病机制。
本研究包含多个严谨衔接的步骤，从候选区域选择、群体筛查到功能验证和机制探索。
第一步：候选区域选择与患者队列构建。 研究者基于两个标准选择了SCN1A基因的11个非编码候选区域进行深度测序：a）基于14种神经元或脑特异性细胞的染色质状态图谱，在SCN1A编码区侧翼2kb内识别了5个可能的增强子或启动子区域；b）在SCN1A内含子20中，基于前期全基因组测序（Genome Sequencing, GS）在一个疑似DS先证者（本研究中的先证者3）中发现的一个具有高CADD评分的de novo变异，进而通过可视化检查GERP（基因组进化速率谱分析）评分，额外选择了5个高度保守的内含子区域。研究队列包括640名临床诊断为DEE但通过已知癫痫基因（包括SCN1A编码区）筛查未找到病因的患者，其中35名临床诊断为DS。
第二步：靶向重测序与变异筛选。 使用单分子分子倒置探针（smMIPs）技术对640名患者的11个候选区域进行靶向捕获和高通量测序。数据分析后，应用严格过滤标准筛选候选致病变异：测序深度>10倍唯一捕获、在队列中出现少于3次、不存在于千人基因组、Kaviar、gnomAD和TopMed等公共基因组数据库中。同时对测序数据进行了拷贝数变异（CNV）分析，并使用定制高密度芯片进行验证。此外，对先证者3的变异（最初由GS发现）也纳入分析。
第三步：变异的群体遗传学与生物信息学分析。 为评估所发现内含子20变异的疾病关联性，研究者将其与大规模人群基因组数据（TopMed项目，62,784个个体；gnomAD项目，15,496个基因组）进行比较。他们特别关注“单例变异”（singleton variants），即在两个队列中均只在一个个体中出现的杂合变异。通过计算比值比（OR）和Fisher精确检验（FET）评估其在DEE和DS患者中的富集程度。同时，使用CADD和GERP评分评估变异的保守性和有害性，并与Clinvar数据库中已知致病变异的CADD评分进行对比。
第四步：剪接报告基因实验（功能验证）。 由于SCN1A在血液或成纤维细胞系中表达量低，为直接测试内含子20变异对剪接的影响，研究者构建了剪接报告基因系统。他们将包含SCN1A外显子20、整个内含子20和外显子21的基因组序列（约7.5 kb）克隆到报告载体（pdestsplice）中。通过定点诱变，分别构建了包含5个先证者特异性变异的报告基因载体。将这些载体分别转染至不内源性表达SCN1A的人细胞系（K562和A549）中，24小时后提取RNA，通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测不同剪接产物的比例。主要检测：1）正确剪接的SCN1A（外显子20:外显子21连接）；2）包含“毒性外显子”20N的剪接产物（20N:外显子21连接以及外显子20:20N连接）。通过比较变异型与野生型（WT）报告基因中20N的包含水平，评估变异对剪接的影响。
第五步：机制探索与RNA结合蛋白分析。 基于功能实验的结果，研究者进一步探索变异影响剪接的分子机制。他们利用ENCODE计划中的CLIP-seq（紫外交联免疫沉淀测序）和RNAi knockdown RNA-seq公共数据，分析SCN1A基因20N区域结合的RNA结合蛋白（RBPs）。特别关注了在HepG2细胞中与20N区域结合的蛋白，以及敲低这些蛋白后对SCN1A剪接的影响。此外，他们使用生物信息学工具（如MEME-suite, CISBP-RNA, ATtRACT）分析变异是否破坏或创造了已知的RBP结合基序。
1. 非编码变异的发现与统计富集： 在640名DEE患者中，共发现6个可能的致病变异，它们均位于SCN1A的注释外显子之外，包括4个内含子20点变异/小缺失和2个上游缺失（涉及脑特异性转录起始位点）。这6个变异中有4个存在于DS患者中。仅统计DS患者（35人），致病/可能致病变异的检出率显著提高（6/35）。对5个内含子20变异（位于一段692 bp的高度保守区域）的群体遗传学分析显示：在DEE队列中，该区域的单例变异频率（4/640，0.62%）显著高于TopMed对照人群（42/62,784，0.067%），OR=9.39, p=1.2e-3；在DS患者中富集程度更高（4/35，11.4% vs 0.067%，OR=192.76， p=1e-5）。这些变异的CADD评分中位数（16.7）显著高于TopMed对照人群中的单例变异（中位数11.3，p=8.7e-4），且与Clinvar中已知致病变异的评分百分位（7th-9th）相当，GERP保守性评分也接近编码外显子水平。
2. 上游缺失的致病机制： 两个上游缺失分别位于SCN1A基因上游约92kb和107kb处，它们均包含了从脑特异性染色质图谱中预测出的启动子区域。公共脑RNA-seq数据显示这些区域是SCN1A在脑中主要的转录起始位点。这些缺失很可能通过导致单倍体不足（haploinsufficiency）而引起DS，这与SCN1A截短变异和其他上游缺失的致病机制一致。
3. 内含子20变异的功能验证——促进“毒性外显子”20N的包含： 剪接报告基因实验提供了关键的功能证据。结果表明，先证者1、2、3的变异在K562和A549细胞系中均显著增加了毒性外显子20N的包含（见图1B，S2）。20N是一个位于内含子20中、高度保守的64 bp外显子，其包含会导致阅读框移位并引入提前终止密码子，可能引发无义介导的mRNA降解（Nonsense-Mediated Decay, NMD）或产生截短蛋白，从而减少全长功能性SCN1A蛋白的数量。这直接支持了这些内含子变异通过异常剪接导致SCN1A功能丧失的致病假说。
4. 变异影响剪接的可能分子机制： a) 对于先证者2和3的变异：它们均位于20N外显子内部一个高度保守的SRSF1（丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1）结合基序内。公共数据表明，SRSF1蛋白结合于20N区域；在HepG2细胞中敲低SRSF1会导致20N包含增加。因此，研究者提出，SRSF1在20N的结合通常起到抑制其包含的作用，而先证者2和3的变异破坏了SRSF1结合基序，减少了SRSF1的结合，从而解除了抑制，导致20N异常包含。b) 对于先证者1的变异：该变异位于20N下游，其剪接报告结果显示对20N下游剪接位点（20N:外显子21）的影响远大于上游（外显子20:20N），提示该变异可能优先影响20N下游内含子的切除，或产生一种同时包含上游部分内含子序列和20N的异常转录本。c) 对于先证者4和5的变异（距20N约250 bp）：在报告基因实验中未观察到对20N剪接的明显影响。生物信息学预测它们可能破坏NOVA1结合位点，但其在非神经元细胞系中的功能影响可能需要更特异的细胞环境（如神经元）才能显现。
5. 临床表型与遗传模式： 携带内含子20变异的5个先证者/家系表现出与SCN1A编码变异一致的临床谱系。4人诊断为典型DS，1人（先证者3）经重新评估后诊断为癫痫伴热性惊厥附加症（Febrile seizures plus, FS+）。在可获得家系数据的家庭中，变异与包括遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus, GEFS+）在内的较轻表型共分离，显示了不完全外显率和表型变异性，这与许多SCN1A编码变异（特别是与GEFS+相关的）的特点相符。
本研究得出结论：SCN1A基因内含子20和其他非编码调控区域的罕见变异，是导致Dravet综合征及相关SCN1A关联性遗传癫痫的一个重要且此前被忽视的病因。这些变异通过破坏精细的剪接调控，特别是促进一个高度保守的“毒性外显子”（20N）的异常包含，导致功能性SCN1A蛋白减少，从而引发疾病。这一机制与SCN1A功能丧失性变异的总体致病范式一致。
科学价值： 1） 病因学突破：将部分“未解之谜”DEE（特别是DS）的遗传病因从编码区扩展至非编码区，解释了部分ES阴性的病例，提高了诊断率。2） 揭示新致病机制：系统性地证实了“毒性外显子”异常剪接作为人类神经系统疾病（尤其是癫痫）的一种新型分子机制。这不仅限于SCN1A，文中指出转录组研究已发现数百个毒性外显子，存在于其他钠通道基因及更广泛的神经发育相关基因中，提示该机制的广泛相关性。3） 方法论示范：展示了结合靶向重测序（针对进化保守和功能特征区域）、群体遗传学富集分析、体外剪接报告基因功能验证以及利用公共组学数据（CLIP-seq, RNA-seq）进行机制探索的综合研究策略，为研究非编码变异提供了范本。4） 推动基因组注释：本研究直接促使了GENCODE数据库在2018年4月的版本更新中，将SCN1A的20N外显子及相关脑特异性转录起始位点纳入正式注释，强调了功能研究对完善基因组注释的重要性。
应用价值与未来方向： 1） 临床诊断：研究结果强烈建议对临床怀疑为DS或其他SCN1A相关癫痫但ES阴性的患者，应进行针对SCN1A特定非编码区域（尤其是内含子20高保守区）或全基因组测序（GS）以寻找此类变异。2） 治疗新策略：研究结果为开发RNA靶向疗法带来了希望。正如脊髓性肌萎缩症的治疗所示，通过反义寡核苷酸（ASOs）等技术调控异常剪接是可行的治疗途径。深入理解调控20N剪接的神经元特异性机制，可能有助于设计靶向性疗法，选择性地纠正异常剪接，恢复SCN1A正常功能，为DS等难治性癫痫提供新的治疗思路。