诱导多能干细胞来源外泌体通过靶向HIF-1α和Runx2缓解肺动脉高压血管重构的研究报告

第一作者及机构
本研究由台湾高雄荣民总医院的Pei-Ling Chi（第一作者）联合Chin-Chang Cheng、Mei-Tzu Wang等共8位作者完成，通讯作者为Wei-Chun Huang（邮箱：wchuanglulu@gmail.com）。研究团队来自高雄荣民总医院的多个部门，包括医学教育与研究部、病理与检验医学部、重症医学部等，并与台湾阳明交通大学及辅英大学合作。研究成果于2024年1月22日在线发表于心血管领域权威期刊《Cardiovascular Research》（2024年第120卷，203-214页），DOI: 10.1093/cvr/cvad185。

学术背景
肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension, PAH）是一种以肺血管阻力进行性升高和闭塞性血管重构为特征的致命性疾病，最终导致右心室肥厚和心力衰竭。尽管现有疗法可缓解症状，但患者预后仍不理想。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）衍生的外泌体（exosomes）虽在PAH中显示保护作用，但MSCs存在体外扩增时衰老受限的问题。相比之下，诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）具有更强的增殖能力和稳定性。然而，iPSCs直接移植可能引发免疫排斥，而iPSCs分泌的外泌体（iPSC-exo）作为无细胞疗法，可能规避这一问题。本研究旨在探索iPSC-exo对PAH血管重构的调控机制，重点关注其对缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和Runt相关转录因子2（Runx2）的靶向作用。

研究流程
1. iPSC-exo的制备与表征
- 细胞培养：从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）通过三因子（Oct4、Klf4、Sox2）转导生成iPSCs，培养于含白血病抑制因子（LIF）的无血清培养基中。
- 外泌体分离：超速离心法（100,000×g, 90分钟）结合Exosome Isolation试剂纯化外泌体，透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）确认其形态（平均直径121.0±3.9 nm）及标志物（CD9、CD63）。
- 体内分布实验：PKH26荧光标记iPSC-exo腹腔注射至PAH模型大鼠，24小时后通过活体成像（IVIS）检测外泌体在肺、肝、肾的富集。

1. PAH动物模型构建与治疗

   • 模型建立：雄性SD大鼠皮下注射野百合碱（Monocrotaline, MCT, 60 mg/kg）诱导PAH。
     
   • 治疗分组：分为（1）生理盐水对照组；（2）早期iPSC-exo治疗组（MCT注射后立即给药）；（3）晚期iPSC-exo治疗组（MCT注射2周后给药）；（4）iPSC条件培养基（iPSC-CM）对照组。每日腹腔注射治疗，28天后评估。
     
   • 检测指标：右心室收缩压（RVSP）、右心室肥厚指数[RV/(LV+S)]、肺小动脉肌化程度（EVG染色及α-SMA免疫组化）。
     

2. 细胞实验机制解析

   • 原代PASMC分离：从MCT处理大鼠肺动脉分支提取PASMC，检测增殖（BrdU、MTT法）和迁移（划痕实验）。
     
   • 分子机制：Western blot分析PCNA、Cyclin D1、MMP-9/10表达；免疫荧光观察HIF-1α和Runx2核转位；siRNA敲低验证靶基因功能。
     
   • 信号通路：发现iPSC-exo通过抑制PAK1/Akt/Runx2轴和HIF-1α下调，减少PASMC增殖与迁移。
     

主要结果
1. iPSC-exo改善PAH病理表型
- 早期和晚期治疗均显著降低RVSP（分别减少35%和28%）和右心室肥厚指数（P<0.01），且效果优于iPSC-CM。
- 肺小动脉壁厚/管腔直径比下降50%，α-SMA阳性面积减少60%（P<0.01）。

1. 抑制PASMC异常表型

   • iPSC-exo处理使MCT-PASMC的增殖率（MTT）降低40%，迁移能力（划痕愈合率）下降55%。
     
   • Western blot显示Cyclin D1、PCNA、MMP-9/10表达显著下调（P<0.05）。
     

2. 机制验证

   • HIF-1α和Runx2在MCT-PASMC中高表达，经iPSC-exo处理后其mRNA和蛋白水平均降低（P<0.01）。
     
   • siRNA敲低HIF-1α或Runx2后，PASMC增殖迁移能力减弱，证实其为关键靶点。
     
   • iPSC-exo通过抑制PAK1/Akt磷酸化阻断Runx2激活，形成级联调控网络。
     

结论与价值
本研究首次证实iPSC-exo可通过靶向HIF-1α/Runx2通路缓解PAH血管重构，其科学价值在于：
1. 机制创新：揭示iPSC-exo调控PAK1/Akt/Runx2轴的新机制，为PAH提供精准治疗靶点。
2. 治疗优势：相较于传统MSC-exo，iPSC-exo具有更稳定的增殖能力和标准化生产潜力。
3. 转化意义：为开发无细胞疗法奠定基础，规避iPSCs移植的免疫排斥风险。

研究亮点
1. 方法学创新：结合超速离心与商业化试剂盒优化外泌体纯化流程，提升得率与纯度。
2. 模型设计：同时评估早期预防和晚期逆转治疗效果，更贴近临床需求。
3. 多维度验证：从动物模型到原代细胞实验，辅以siRNA功能回补，证据链完整。

其他价值
研究团队提出iPSC-exo的临床转化路径，下一步需解决规模化生产、剂量优化及长期安全性问题。外泌体miRNA组学分析或可进一步揭示其调控网络。