本研究由Jiawei Zou、Xin Huang、Lei Wu、Gangyi Chen、Juan Dong、Xin Cui和Zhuo Tang共同完成，作者单位均来自中国科学院成都生物研究所天然产物研究中心。研究成果发表于2015年11月的《Journal of Molecular Evolution》，标题为《Selection of Intracellularly Functional RNA Mimics of Green Fluorescent Protein Using Fluorescence-Activated Cell Sorting》。

学术背景

该研究属于合成生物学与RNA工程交叉领域，旨在解决活细胞内RNA示踪的技术瓶颈。传统RNA标记方法如荧光蛋白标签（fluorescent protein tagging）可能干扰RNA功能，而寡核苷酸探针（oligonucleotide probes）易被核酸酶降解且灵敏度低。2012年，Jaffrey团队开发的Spinach RNA适体（aptamer）通过结合小分子染料DFHBI（3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone）可模拟绿色荧光蛋白（GFP）功能，但存在亮度不足（仅为EGFP的50%）和细胞内稳定性差的问题。本研究提出直接利用荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）从细胞内筛选高性能RNA荧光适体，以突破传统体外筛选（SELEX）与细胞环境不兼容的局限。

研究流程

1. 文库设计与构建

   • 以Spinach适体为框架，对其三个关键功能域（10-15、23-28、33-42位核苷酸）进行随机化设计，构建含22个随机位点的DNA文库。
     
   • 通过tRNA支架（anti-code loop插入）增强RNA稳定性，克隆至pET21a载体，电转化至大肠杆菌（E. coli），获得约5×10⁸转化子文库。
     

2. FACS筛选流程

   • 诱导表达：IPTG诱导RNA表达后，加入DFHBI染料。
     
   • 分选参数：使用MoFlo™ XDP分选仪，488 nm激光激发，529/28 nm滤光片检测，分选门设定为前0.01%荧光强度细胞。
     
   • 迭代筛选：共6轮筛选，首轮分选5×10⁵个细胞，后续每轮约7×10⁴个细胞，每轮耗时3小时。
     

3. 适体表征

   • 测序分析：从第6轮筛选池中挑选50个克隆测序，鉴定出两类新适体ZT-26和ZT-324。
     
   • 荧光检测：通过流式细胞术比较细胞内荧光强度，并通过体外转录RNA测定DFHBI结合活性。
     

主要结果

1. 稳定性优化验证

   • 将Spinach插入tRNA反密码环（sIII构型）可使大肠杆菌荧光强度提升至未保护构型（sI）的10倍以上（图2b-c），证实tRNA支架对RNA稳定的关键作用。
     

2. 新适体性能

   • ZT-324：细胞内荧光强度比Spinach高36%（图3c），但体外荧光仅为其1.2倍（图3d），表明其细胞内高活性可能源于表达效率提升。
     
   • ZT-26：体外荧光为Spinach的2倍，但细胞内活性仅50%，提示其可能受细胞内环境抑制。
     

3. 筛选策略优势

   • 直接基于细胞内荧光表型筛选，避免了传统SELEX对体外结合亲和力的偏倚，首次实现从全细胞层面优化RNA适体功能。
     

结论与价值

本研究开创了“细胞内功能导向”的RNA适体筛选范式，其科学价值体现在：
1. 方法学创新：FACS直接筛选策略将单轮时间缩短至3小时，且可检测低至10个细胞的稀有克隆（图2e），为快速获取功能性核酸工具提供新路径。
2. 应用潜力：ZT-324的亮度提升为活细胞RNA动态观测提供更灵敏的探针，且该策略可扩展至其他荧光染料适配体的开发。

研究亮点

• 原创筛选体系：首次将FACS全程用于细胞内RNA适体筛选，突破体外筛选与体内功能脱节的难题。
  
• 结构-功能发现：揭示tRNA反密码环插入是增强RNA稳定性的有效策略（图2a），为后续设计提供模板。
  
• 跨学科技术整合：结合合成生物学（文库设计）、单细胞技术（FACS）和生物信息学（测序分析），推动RNA工具开发进入高通量时代。
  

其他价值

作者指出，未来可探索完全随机序列文库的筛选潜力，并拓展至多色荧光RNA系统构建（如结合其他氟化染料），这将为细胞多参数成像提供全新工具。研究获中国国家自然科学基金（21172215、21322208等）支持，相关质粒与实验方案已通过论文补充材料公开。