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本文介绍了一项由西北农林科技大学动物科技学院张智英教授和徐坤教授团队主导完成的研究，合作单位包括华南师范大学生命科学学院广州昆虫发育调控与应用研究重点实验室以及新乡医学院肺与分子治疗研究所。该研究于2017年9月18日在线发表于*International Journal of Biochemistry and Cell Biology*第92卷，第一作者为Simin Shao。研究聚焦于CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（homology-directed repair，HDR）效率提升问题，提出通过表达酿酒酵母RAD52蛋白来增强哺乳动物细胞中的精确基因组编辑效率。

在学术背景方面，CRISPR/Cas9技术已经成为哺乳动物基因组定点修饰的强大工具，其通过引导RNA（sgRNA）指导Cas9核酸酶在特定位点产生DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）。细胞内的DSB修复主要通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（HDR）两条竞争性途径完成。NHEJ途径会产生不可控的插入或缺失（indels），导致靶基因功能丧失；而HDR途径依赖同源供体模板，能够实现精确的点突变、插入或缺失，对基因功能研究、基因治疗和动物育种具有重要意义。然而，在哺乳动物细胞中，HDR效率天然较低，限制了精确基因组编辑的应用。已有研究尝试通过抑制NHEJ通路（如使用DNA连接酶IV抑制剂SCR7）来间接提高HDR效率，但直接调控同源重组关键蛋白的策略报道较少。RAD52是同源重组过程中的重要蛋白，在酿酒酵母中主要负责DSB修复。基于此，作者假设在CRISPR/Cas9系统中共表达或融合表达RAD52能够增强HDR效应。

研究的工作流程可分为以下几个主要环节。第一，作者从酿酒酵母AH109菌株中克隆了RAD52基因，并构建了由CBH启动子驱动的表达载体pcbh-rad52。同时，他们基于pLL3.7载体构建了CRISPR/Cas9表达系统，并将RAD52基因克隆到Cas9的N端，形成rad52-cas9融合表达载体。第二，为了快速定量HDR事件，研究团队设计并构建了两种替代报告系统（surrogate reporter systems）：“供体整合型”（donor integrated）和“供体分离型”（donor detached）报告系统。前者将截短且倒置的EGFP片段（ti-egfp）整合在报告质粒内部，同时含有DsRed标记基因；后者则简化设计，去除了DsRed，并使用PCR扩增的ti-egfp片段作为外源供体。这两种报告系统中，EGFP报告基因的开放阅读框被终止密码子和sgRNA靶位点打断，只有在CRISPR/Cas9切割后通过HDR修复才能恢复EGFP表达，从而可通过荧光显微镜观察和流式细胞术定量HDR效率。第三，在HEK293T细胞中分别进行了RAD52共表达和RAD52-Cas9融合表达实验，比较两种策略对HDR效率的影响。第四，在人HEK293T细胞中对VEGF和CCR5基因位点进行了基因组编辑实验，使用质粒供体、PCR产物供体和单链DNA（ssDNA）供体等多种供体形式，并通过XbaI限制性内切酶消化实验和TA克隆测序验证HDR介导的精确编辑效率以及NHEJ介导的indel频率。此外，还利用基于单链退火（single strand annealing，SSA）途径的DsRed-PuroR-EGFP（RPG）替代报告系统富集基因组修饰细胞。第五，在猪PK15细胞中应用RAD52-Cas9融合策略，针对胰岛素样生长因子2（IGF2）基因内含子3中的G>A单核苷酸多态性（SNP）位点进行HDR介导的精确修饰，供体构建同时引入了期望的G>A替换和突变PAM序列，以防止Cas9的二次切割。实验样本量方面，HEK293T和PK15细胞均以每孔9×10^5个细胞接种于6孔板，每个质粒组设三个平行转染，每组约4 μg质粒。基因组编辑实验中，转染后经嘌呤霉素筛选5天，收集抗性细胞克隆，提取基因组DNA进行后续分析。

研究的主要结果如下。在替代报告系统验证中，两种报告系统均能有效反映CRISPR/Cas9介导的HDR事件，但“供体整合型”报告系统存在一定的EGFP背景表达，而“供体分离型”报告系统背景较低。RAD52共表达实验显示，在“供体整合型”和“供体分离型”报告系统中，HDR效率分别达到6.1%和6.0%，分别是对照组的2.8倍和2.7倍。RAD52-Cas9融合策略在两种报告系统中分别实现了6.5%和7.2%的HDR效率，分别是对照组的3.3倍和3.4倍，表明融合策略与共表达策略效果相近，但融合策略减少了转染质粒数量，可能具有更高的转染效率和更好的RAD52在DSB位点的局部组装效果。在人HEK293T细胞的基因组编辑实验中，RAD52共表达策略在VEGF和CCR5位点分别实现了5.3%和11.9%的精确编辑效率，分别为对照组的2.8倍和2.2倍；而RAD52-Cas9融合策略表现更优，分别达到8.4%和14.7%，为对照组的3.7倍和3.2倍。测序分析进一步证实，在VEGF位点，RAD52-Cas9介导的HDR编辑频率是对照的3.3倍，而NHEJ编辑频率仅为对照的0.8倍；在CCR5位点，HDR编辑频率为对照的3.8倍，NHEJ编辑频率为对照的0.7倍。这表明RAD52-Cas9融合不仅增强了HDR，还在一定程度上抑制了NHEJ。在供体模板形式的比较中，质粒供体、PCR产物供体和ssDNA供体均能观察到RAD52-Cas9融合对HDR的增强效应，其中ssDNA供体组的增强倍数为2.4倍。此外，RAD52-Cas9融合与SCR7联合使用时，HDR效率可提高至约40%，显示出协同增强效应。在猪PK15细胞中，针对IGF2基因内含子3的SNP位点，RAD52-Cas9融合组的HDR精确编辑频率为28.0%，而对照组为12.7%，提高了2.2倍；NHEJ indel频率在融合组为52.0%，低于对照组的60.3%，再次证实了融合策略在增强HDR的同时可轻微抑制NHEJ。

研究的结论是，通过表达酿酒酵母RAD52蛋白，特别是采用RAD52-Cas9融合策略，能够显著增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率，在替代报告系统和基因组编辑实验中均稳定提升约3倍左右。该策略在不同供体形式（质粒、PCR产物和ssDNA）下均有效，并且与SCR7联合使用可进一步提高HDR效率至约40%。这一发现为哺乳动物细胞中的精确基因组编辑提供了一种简便有效的优化方案，在基因功能研究、基因治疗和动物育种等领域具有广泛的应用前景。

本研究的亮点在于：其一，首次系统比较了RAD52共表达与RAD52-Cas9融合两种策略对CRISPR/Cas9介导HDR的增强效果，证实融合策略在减少质粒数量的同时保持甚至略优于共表达的效果；其二，开发了两种基于EGFP恢复的替代报告系统，可快速可视化和定量HDR事件；其三，在两种不同物种的哺乳动物细胞（人HEK293T细胞和猪PK15细胞）中验证了该策略的普适性；其四，证明了RAD52-Cas9融合对多种供体模板形式均具有增强作用，并与SCR7具有协同效应。此外，研究中使用的RPG替代报告系统基于SSA途径，可有效富集基因组修饰细胞，提高了后续检测的灵敏度。该研究为未来精准基因组编辑技术的优化和应用提供了重要的实验依据和技术储备。