关于“LGR6在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用”的研究报告

研究作者和机构

本研究由Mengmeng Zhao, Zihui Zheng, Jianfang Liu等作者完成，主要单位包括武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管研究所以及湖北省心血管重点实验室，研究结果发表在《Redox Biology》期刊2024年第78卷上，文章DOI为10.1016/j.redox.2024.103400，于2024年10月16日在线发布。

研究背景与目的

心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury, I/R Injury）是全球范围内导致心血管死亡的重要原因。尽管再灌注治疗能够通过恢复血流来减少心肌梗死大小并保护心功能，但这种过程却可能引发再灌注损伤，导致心肌细胞凋亡和程序性坏死（necroptosis）等病理变化。现有研究表明，necroptosis在缺血性心脏病以及心肌重构中起重要作用，其关键调控分子包括RIPK1、RIPK3和MLKL。然而，目前针对necroptosis的干预手段尚未显示出确切的临床效果。

LGR6（Leucine Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 6）是一种富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体，已被证实参与多种心血管疾病的发病进程，包括肺动脉高压和移植物缺血-再灌注损伤等。然而，LGR6在心肌缺血再灌注中的具体作用及其机制尚未明确。因此，本研究旨在探索LGR6对心肌细胞necroptosis的调控作用及其分子机制，并评估通过激活LGR6是否可以有效保护心肌免受缺血再灌注损伤。

研究流程与方法

1. 研究对象与模型构建

• 动物模型
  本研究构建了LGR6基因敲除小鼠（LGR6 KO）和野生型（WT）小鼠模型，并通过结扎左前降支冠状动脉（左前降支远心室尖1 mm处），模拟体内的缺血-再灌注损伤。研究中每组动物包括4至6只小鼠以获得具有统计学意义的结果。

• 细胞模型
  体外实验采用了HL1小鼠心肌细胞系和H9C2大鼠心肌细胞系，构建缺氧-复氧（Hypoxia-Reoxygenation, HR）模型，以模拟缺血再灌注导致的细胞损伤。

• 基因编辑与病毒载体构建
  为明确LGR6的功能，研究采用CRISPR技术敲除小鼠LGR6，并通过腺相关病毒（AAV9-CTNT-LGR6）在心肌细胞中特异性过表达LGR6。另外，设计了针对ZBP1和STAT2的短发夹RNA（shRNA）以实现其心肌细胞特异性敲低。

2. 实验设计与检测分析

实验流程与具体措施

1. LGR6表达的变化检测：
   通过qRT-PCR、免疫荧光以及Western Blot分别检测缺血-再灌注损伤及缺氧-复氧处理后，LGR6在小鼠心脏组织和心肌细胞中的表达水平变化。

2. LGR6在心肌损伤中的功能分析：
   比较WT与LGR6 KO小鼠在I/R损伤后24小时的心肌梗死面积、血清肌钙蛋白T（cTnT）和乳酸脱氢酶（LDH）水平等。

3. 关键分子通路探索：
   运用RNA测序及芯片实验（ChIP assay）检测LGR6下游靶基因及信号通路，筛选其调控心肌细胞necroptosis的分子依据。

4. Wnt通路的调控：
   通过RNA干扰（siRNA）及荧光素报告基因实验，评估Wnt通路在LGR6调控中的作用，并研究LGR6对关键受体FZD2的蛋白翻译后修饰及其泛素化过程的影响。

5. 靶基因功能验证：
   针对ZBP1、STAT2，下调或过表达相关基因，并检测其对心肌细胞活力及necroptosis的影响。

主要研究结果

1. LGR6表达显著下调：
   在小鼠心肌缺血再灌注损伤和HR条件下，LGR6表达显著下调，尤其是在梗死边缘区。过表达LGR6显著减少损伤面积和血清标志物水平，提示LGR6对心肌有保护作用。

2. LGR6敲除激活心肌细胞necroptosis：
   在LGR6 KO小鼠中，心肌梗死面积明显扩大，PI染色标记的坏死心肌细胞增多，同时RIPK1、RIPK3及MLKL的磷酸化水平显著升高，说明LGR6敲除会加重心肌necroptosis过程。

3. r-Spondin3-LGR6轴激活Wnt信号通路：
   生物信息学分析结合实验验证发现，r-Spondin3（RSPO3）通过与LGR6结合，促进Wnt信号通路的活化。同时，LGR6能通过下调E3泛素连接酶ZNF3的表达，抑制Wnt受体FZD2的泛素化降解，从而提高Wnt通路活性。

4. LGR6通过抑制STAT2和ZBP1缓解necroptosis：
   嵌合免疫沉淀结合qPCR实验及双荧光素酶报告基因实验显示，STAT2通过促进炎性通路中关键分子ZBP1的转录，诱导心肌细胞necroptosis。而LGR6通过Wnt通路下调STAT2，从而间接减轻ZBP1表达和necroptosis反应。

5. RSPO3作为潜在治疗剂具有保护作用：
   在小鼠模型中给予重组RSPO3蛋白，观察到其能够显著减少心肌梗死面积、改善心肌功能并降低坏死相关分子标志物的表达水平，提示LGR6和其激活剂RSPO3均具有潜在的临床应用价值。

研究结论

本研究首次揭示了RSPO3-LGR6轴通过激活Wnt通路，抑制STAT2/ZBP1通路，从而减轻心肌缺血再灌注损伤的机制。这一机制为RSPO3或LGR6作为治疗心肌再灌注损伤的新型靶点提供了理论依据。同时，研究结果进一步拓展了Wnt信号通路在心血管疾病中的研究范围。

研究亮点

• 创新：首次引入RSPO3-LGR6信号轴，明确其对心肌细胞necroptosis的调控作用；
• 临床意义：发现RSPO3作为LGR6激活剂，有望成为治疗心肌再灌注损伤的潜在候选药物；
• 方法学优势：采用多种研究手段，包括CRISPR基因编辑、RNA测序及荧光素报告基因实验，确保数据可靠性。

进一步研究方向

• 探索LGR6在其他类型心血管疾病中的作用；
• 开发专一性更高的小分子LGR6激活剂；
• 在临床试验中验证RSPO3的安全性和有效性。

此研究为心肌再灌注损伤的防治提供了新的思路和方法，其科学价值和应用潜力具有重要意义。