热带假丝酵母（Candida tropicalis）无标记基因组编辑系统的开发及长链二元酸生产代谢通路工程研究
第一作者及机构
本研究的通讯作者为Junqing Wang（王俊清），来自齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室（State Key Laboratory of Biobased Material and Green Papermaking, Qilu University of Technology）。合作作者包括Jian Peng（彭建）、Han Fan（范涵）等共9位研究者。研究发表于《Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology》2018年9月刊，DOI: 10.1007/s10295-018-2074-9。
学术背景
热带假丝酵母是一种可利用烷烃或植物油为唯一碳源的工业微生物，其通过ω-氧化途径将脂肪酸转化为长链二元酸（long-chain dicarboxylic acids, LCDAs）。这类化合物是合成航空润滑油、高性能尼龙工程塑料和高档香料的重要中间体。然而，传统基因编辑依赖抗生素抗性标记，残留的筛选标记基因可能限制菌株的进一步改造。此外，脂肪酸β-氧化途径会竞争性消耗目标产物，降低LCDAs产率。
本研究旨在开发基于mazF毒素基因的无标记基因组编辑系统（markerless genome editing system），并通过代谢工程改造热带假丝酵母，阻断β-氧化通路、强化ω-氧化关键酶表达，最终提升LCDAs产量。
研究流程与方法
1. 无标记编辑系统构建
- 自杀质粒ppicpj-mazF设计：
以大肠杆菌mazF基因为反向筛选标记（counterselectable marker），该基因编码的mRNA干扰酶可切割ACA序列的单链mRNA，抑制蛋白质合成导致细胞死亡。研究团队将mazF与解脂耶氏酵母（Candida lipolytica）的半乳糖诱导型启动子pGAL融合，构建自杀质粒ppicpj-mazF。
- 筛选验证：在含10 g/L半乳糖的YPGS培养基中，mazF表达可有效杀死未完成二次同源重组的菌株，实现无标记编辑。
代谢通路改造
发酵工艺优化
主要结果与逻辑关联
- 编辑系统效率：mazF在10 g/L半乳糖诱导下表现出高反向筛选效率，成功实现crat基因无痕敲除和启动子替换。
- 代谢改造效果：crat缺失削弱β-氧化，而P450和还原酶过表达加速ω-氧化，二者协同将碳流向LCDAs合成。发酵数据表明，菌株生长速率未受显著影响（OD600提升1.26倍），说明代谢负荷可控。
- 工业化潜力：32.84 g/L的产量为目前报道的较高水平，且工艺兼容廉价植物油底物，具有成本优势。
研究结论与价值
1. 科学价值：
- 首次在热带假丝酵母中建立mazF介导的无标记编辑系统，为复杂基因组操作提供新工具。
- 阐明了β-氧化与ω-氧化通路竞争关系，提出“阻断-强化”双策略优化LCDAs合成。
2. 应用价值：
- 改造菌株pjpp1702的LCDAs产率提升11.4倍，显著降低生产成本。
- 该技术可扩展至其他工业酵母的代谢工程，如生物燃料或高值化学品生产。
研究亮点
- 技术创新性：
- 融合异源pGAL启动子与mazF毒素基因，开发出适用于热带假丝酵母的高效反向筛选系统。
- 采用重叠PCR（overlap PCR）和一步克隆技术（one-step cloning）快速构建多片段重组载体。
- 成果突破性：
- 32.84 g/L的LCDAs产量为同类研究最高水平之一，且工艺可直接放大至工业发酵。
其他有价值内容
- 副产物控制：GC-MS分析显示改造菌株几乎无其他长链二元酸副产物，表明代谢流定向性极强。
- 碳源适应性：菌株能利用玉米油中多种脂肪酸（油酸、亚油酸等），拓宽了原料选择范围。
总结
本研究通过合成生物学与代谢工程的结合，不仅解决了热带假丝酵母基因编辑的技术瓶颈，还为LCDAs的绿色制造提供了高效菌株和工艺范本。未来可进一步优化P450酶系或引入动态调控通路，突破产物积累上限。