本文属于类型a，即单项原创研究报告。

该研究由南洋理工大学化学与生物医学工程学院的Dang T. Nguyen、Bob Hartadhi Tji Soeranaya、Thi Hong Anh Truong与Tram T. Dang完成，发表于 Acta Biomaterialia 第117卷，2020年，第167至179页。

研究背景

慢性炎症是类风湿关节炎、慢性糖尿病溃疡、炎症性肠病及慢性阻塞性肺病等多种疾病的重要病理基础。目前临床上主要采用全身给予非甾体抗炎药或糖皮质激素来抑制炎症，但全身给药常导致药物过量暴露，引起心肌梗死、胃溃疡、青光眼或机会性感染等严重不良反应。为改善药物释放的时空控制并降低全身毒性，已有多种局部药物递送系统被开发。然而，多数系统仅依赖材料自身理化性质实现持续释放，未充分利用病变组织中炎症相关生物信号。慢性炎症部位常伴随蛋白酶活性升高，尤其是基质金属蛋白酶-9，其在慢性伤口、关节炎及皮肤水疱性疾病中表达上调。基于此，本研究旨在开发一种模块化、免疫相容且可在室温下注射或局部应用的蛋白酶触发药物递送平台，以响应炎症微环境中的基质金属蛋白酶-9活性并选择性增强抗炎药物释放，从而调节促炎巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α产生。

研究流程

研究包括多个衔接步骤。首先，研究者通过油包水乳化法制备载有布洛芬的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒，同时制备不含药物的空白微粒。微粒尺寸通过扫描电子显微镜观察，药物载量采用紫外分光光度法测定。随后构建混合水凝胶。水凝胶由四臂聚乙二醇-乙烯砜与双半胱氨酸多肽交联剂通过迈克尔加成反应形成。研究者筛选了8种多肽序列，评估其成胶能力及被基质金属蛋白酶-9裂解的能力。最终选择序列为GCRR-KGPRSLSGK-RRCG的肽作为可裂解交联剂，并选择序列为GCRR-KSSRGGPLK-RRCG的乱序肽作为不可裂解对照交联剂。载药微粒以5%质量体积比悬浮于前体溶液中，成胶后形成包埋微粒的水凝胶。为验证蛋白酶触发释放，研究者将水凝胶暴露于3 μg/ml基质金属蛋白酶-9溶液中，通过光学显微镜观察微粒释放情况，并采用流变仪测定储能模量与损耗模量以确认成胶。体外药物释放实验比较了可裂解水凝胶、不可裂解水凝胶及加入基质金属蛋白酶-9抑制剂时的布洛芬释放动力学。实验在37摄氏度、30 rpm摇动条件下进行，定时取样并通过高效液相色谱定量布洛芬浓度。为评估抗炎效果，研究者使用脂多糖刺激RAW 264.7小鼠巨噬细胞建立促炎模型，并将水凝胶在不同条件下产生的释放液加入细胞培养体系，随后用酶联免疫吸附试验测定肿瘤坏死因子-α分泌水平。体内免疫相容性评价采用免疫健全SKH1-E小鼠，在背部皮下注射不同材料制剂，包括载药水凝胶、空白水凝胶、聚乙二醇水凝胶、载药微粒、空白微粒及海藻酸盐水凝胶。在第1、3、5天通过腹腔注射鲁米诺并利用活体成像系统检测活性氧产生的生物发光信号。此外，还将水凝胶前体溶液沉积于Kaltostat®藻酸盐伤口敷料上制备复合敷料，并考察其在基质金属蛋白酶-9存在与否条件下的药物释放能力。

主要结果

在材料构建方面，成功筛选出可快速成胶且能被基质金属蛋白酶-9裂解的多肽交联剂。含该交联剂的前体溶液在室温下形成白色不流动水凝胶，而不含交联剂的对照组保持液态。流变学分析证实储能模量与损耗模量发生交叉，提示成胶。将可裂解水凝胶置于基质金属蛋白酶-9溶液中，水凝胶基质完全消化，光学显微镜下可见大量微粒释放至周围介质；无酶条件下水凝胶保持完整，几乎无微粒释放。不可裂解对照水凝胶在有无酶条件下均极少释放微粒。

体外药物释放结果显示，可裂解水凝胶在基质金属蛋白酶-9存在时，4小时内布洛芬累积释放率达到100%，而无酶条件下仅约25%。加入基质金属蛋白酶-9抑制剂后药物释放被显著抑制。不可裂解水凝胶在同样酶条件下释放仅约40%，证明可裂解多肽交联剂是触发释放的关键。模块化设计进一步显示，通过更换不同的可裂解多肽、改变微粒尺寸或调节微粒载量，均能在1小时内实现不同的药物释放量。更大微粒可降低初期释放速率；增加微粒载量可在相同释放百分比下提高绝对药物释放量；更高酶浓度则导致更多药物释放。

在体外抗炎实验中，经基质金属蛋白酶-9消化可裂解水凝胶所得的释放液处理的巨噬细胞，其肿瘤坏死因子-α相对分泌降至约11%；而相同水凝胶在无酶条件下产生的释放液处理细胞，该分泌约为21%。加入酶抑制剂后相对分泌恢复至26%。不可裂解水凝胶在酶存在时对应释放液处理细胞的肿瘤坏死因子-α分泌仍为24%。游离布洛芬处理细胞的分泌约为10%，与酶触发释放后的可裂解水凝胶接近，表明酶触发释放在模拟炎症条件下能够提供接近游离药物水平的药效。

体内免疫相容性实验显示，聚乙二醇水凝胶与海藻酸盐水凝胶在第1天诱导的活性氧水平相似，表明化学成胶策略未引起明显不利的宿主反应。所有含聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的制剂在第1天引起较高活性氧，但第5天均降至与正常皮肤相同的背景水平。组织学分析也仅观察到微粒相关样本有轻微细胞浸润。这些结果说明该混合水凝胶及其组成材料在皮下注射5天后未引起持续不良免疫反应。体内药物释放实验还显示，使用更易裂解多肽的水凝胶在皮下注射24小时后释放了81%的布洛芬，而另一种水凝胶释放69%。复合敷料实验表明，在基质金属蛋白酶-9存在下，24小时内敷料释放100%布洛芬，无酶时仅释放56%。

结论与意义

本研究成功构建了一种模块化混合水凝胶，可在基质金属蛋白酶-9活性升高时触发抗炎药物释放，调节促炎巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α产生。模块化设计使蛋白酶可裂解亚域和载药亚域能够独立优化，从而实现不同的药物释放动力学。体外实验证明，蛋白酶与底物之间的特异性相互作用是触发药物释放的关键，且该系统在无酶条件下释放较少药物，提示其具有减轻非炎症状态下药物过量暴露及药物诱导细胞毒性的潜力。体内免疫相容性评价表明该平台及其组分不会在5天内引起持续不良宿主反应。该研究为利用不同蛋白酶及其对应底物扩展按需给药系统提供了通用设计框架，并展示了通过注射或局部敷料形式调节慢性炎症的应用前景。

研究亮点

本研究的创新之处在于采用模块化设计将可独立优化的蛋白酶可裂解水凝胶与载药微粒整合，突破了以往平台缺乏通用设计框架的局限。研究直接以酶-底物特异性为触发机制，并通过加入酶抑制剂和不可裂解对照证实了触发释放机制的有效性。材料制备在室温水相中进行，避免了有机溶剂及高温带来的细胞毒性风险，有利于体内应用。此外，该研究将同一平台成功拓展至可注射水凝胶和复合伤口敷料两种应用形式，体现了其多功能性。