这篇研究论文发表于2025年2月12日的Cell Host & Microbe期刊，标题为“mfsd6 is an entry receptor for respiratory enterovirus d68”。研究的主要作者包括刘曦泽、李慧丽、李兆雪、高德龙、周俊峰、倪福顺等，通讯作者为魏伟教授，其工作单位主要为吉林大学第一医院肿瘤中心、吉林大学第一医院病毒与艾滋病研究所等。这项研究属于病毒学与传染病学领域，旨在阐明人类呼吸道病毒EV-D68入侵宿主细胞的分子机制。

学术背景 肠道病毒D68型（Enterovirus D68， EV-D68）是近年来全球范围内引起儿童严重呼吸道疾病及类脊髓灰质炎样急性弛缓性麻痹（acute flaccid myelitis， AFM）的主要非脊髓灰质炎肠道病毒之一。与多数通过粪-口途径传播的肠道病毒不同，EV-D68主要通过呼吸道传播，具有快速社区传播的能力，已成为一个重要的公共卫生问题。病毒的生命周期起始于其与宿主细胞表面受体的结合，这一步骤是病毒感染的关键，也是中和抗体、疫苗和药物干预的重要靶点。尽管已有研究发现唾液酸、细胞间粘附分子5（intercellular adhesion molecule 5， ICAM-5）和硫酸乙酰肝素等分子可以作为EV-D68的受体或辅因子，启动病毒复制，但病毒，尤其是其感染呼吸道靶细胞的确切核心受体仍不完全明确。因此，鉴定EV-D68的关键受体不仅对理解其致病机制至关重要，也为开发有效的干预策略提供了基础。本研究的目标是，通过无偏见的筛选，寻找并鉴定在EV-D68感染中起关键作用的宿主膜蛋白，并基于此发现开发潜在的抗病毒治疗策略。

详细研究流程 本研究包含了一系列逻辑严密的实验程序，从筛选到机制验证，再到治疗策略的开发与应用评估。研究对象主要包括多种细胞系（如HeLa、A549、BEAS-2B、RD、Vero、MDCK等）、原代细胞（人支气管上皮细胞HBECs和原代星形胶质细胞）以及新生ICR小鼠模型。

第一步：建立筛选系统并进行无偏向性RNA干扰筛选 研究人员首先设计并构建了一个用于特异性检测EV-D68感染的GFP报告系统。该系统将病毒蛋白酶3C的识别序列ADKQ｜GPG插入GFP分子中，形成GFP（3Cut）。当EV-D68感染细胞时，其3C蛋白酶会切割该序列，导致GFP荧光淬灭，从而通过测量荧光强度的减弱来指示病毒感染水平。基于此系统，研究团队在易感的HeLa细胞中进行了一项无偏向性的RNA干扰（RNAi）筛选，针对的是宿主细胞的膜蛋白编码基因。筛选进行了三轮独立重复，通过比较siRNA处理组与对照组的荧光强度变化，发现了一个功能研究相对较少的膜蛋白——主要促进因子超家族结构域蛋白6（Major facilitator superfamily domain-containing protein 6， MFSD6），其表达被干扰后对EV-D68感染的影响最为显著。初步数据（表格S1）显示，MFSD6是筛选系统中影响EV-D68病毒复制最关键的宿主因子。

第二步：验证MFSD6对EV-D68感染的关键性 为了进一步验证MFSD6的功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了MFSD6基因敲除（KO）的HeLa细胞系。通过一系列功能实验，他们发现：1）与野生型（WT）细胞相比，MFSD6 KO细胞在EV-D68（流行株MO和KY）感染后，其细胞病变效应（cytopathic effect， CPE）显著减轻（图1d， e）。2）免疫印迹（Western Blot）分析显示，MFSD6 KO细胞内病毒蛋白（如VP1）的积累大幅减少（图1f， g）。3）通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测发现，MFSD6 KO细胞内的病毒RNA（vRNA）复制（图1h， i）以及分泌到细胞培养上清中的vRNA水平（图1j， k）均显著下降。4）病毒滴度测定表明，MFSD6 KO细胞产生的感染性子代病毒数量远低于WT细胞（图1l， m）。这些结果在EV-D68原型株Fermon和另外两个流行株（MO和KY）中均得到验证，表明MFSD6对EV-D68的复制是保守且必需的（图S1a-f）。为了排除脱靶效应，研究者在MFSD6 KO或敲低（KD）的细胞中回补表达了MFSD6蛋白，结果显著恢复了细胞对EV-D68感染的敏感性（图S1g-i），确证了MFSD6的功能特异性。

第三步：在人类呼吸道细胞中验证MFSD6的功能 鉴于EV-D68是呼吸道病毒，研究者在多种呼吸道上皮细胞中验证了MFSD6的作用。在肺腺癌细胞系A549、永生化正常呼吸道上皮细胞系BEAS-2B以及原代分离的人支气管上皮细胞（HBECs）中，敲低MFSD6的表达均能有效抑制EV-D68（包括原型株Fermon和流行株KY）感染所导致的CPE、病毒蛋白合成和子代病毒产生（图2a-g）。同时，作为对照，敲低同一超家族的其他蛋白（如MFSD12和MFSD8）则对病毒感染没有显著影响，突出了MFSD6作用的特异性（图2a-c）。研究还证实，MFSD6在常用的高度易感细胞（如RD细胞）和人胶质母细胞瘤T98G细胞中同样是EV-D68复制所必需的宿主因子（图S2a-o）。

第四步：探究MFSD6与EV-D68病毒颗粒的直接相互作用 为了确认MFSD6是否直接作为病毒受体发挥作用，研究者首先通过共聚焦荧光显微镜成像技术确认了MFSD6主要定位于细胞质膜上（图3a），这为其作为细胞表面受体提供了结构基础。接着，他们采用两种不同的免疫共沉淀（Co-IP）策略来检测MFSD6与EV-D68病毒颗粒的相互作用：一种是在病毒感染过程中进行共沉淀，另一种是将细胞裂解液与纯化的病毒颗粒共孵育后进行共沉淀。两种方法均证实MFSD6能够特异性捕获EV-D68病毒颗粒，而对照蛋白则不能（图3b-e）。更重要的是，高分辨率免疫荧光成像显示，在EV-D68感染期间，MFSD6与病毒结构蛋白VP1在细胞膜上存在明显的共定位现象（图3f， g），这为MFSD6在细胞膜上识别病毒颗粒提供了直接的视觉证据。

第五步：证实MFSD6促进EV-D68的附着与内进入胞过程 病毒受体的核心功能是促进病毒附着于细胞表面并协助其进入细胞。研究团队通过建立标准的病毒附着和进入实验来验证MFSD6的这一功能（图4a）。结果显示，与WT细胞相比，MFSD6 KO细胞对三种不同EV-D68毒株（Fermon， MO， KY）的附着能力显著下降（图4b-d）。同样，病毒进入细胞的过程也在MFSD6 KO细胞中受到显著抑制（图4e-g）。通过RNAi敲低MFSD6也获得了类似的结果（图S3）。这些数据强有力地支持了MFSD6作为EV-D68入侵受体的功能。

第六步：在非易感细胞中表达MFSD6可重建EV-D68感染 为了提供更直接的“功能获得”证据，研究团队选择了对EV-D68入侵有抵抗力的Vero细胞（非洲绿猴肾细胞系）和Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。他们在这些细胞中稳定表达了人源MFSD6（图5a， i）。功能实验表明，表达MFSD6后，EV-D68病毒在这些细胞中的附着（图5b， i）和进入（图5c， j）能力均显著增强。更重要的是，EV-D68能够感染表达MFSD6的Vero和MDCK细胞，引发明显的CPE（图5d），在感染早期（6小时和12小时）即可检测到病毒RNA（图5e），并检测到病毒蛋白的表达（图5f），同时产生高滴度的感染性子代病毒（图5g， h， k）。这表明MFSD6的表达足以使原本不敏感的细胞变得对EV-D68易感，从而支持了MFSD6作为功能受体的结论。

第七步：基于MFSD6开发并验证工程化重组蛋白的抗病毒活性 基于上述发现，研究者希望通过阻断MFSD6与病毒的相互作用来抑制感染。他们首先通过生物信息学分析和AlphaFold人工智能预测，确定了MFSD6蛋白包含12个潜在的跨膜结构域，并具有多个胞外域（图S4a-d）。特别值得注意的是，预测显示其第二个胞外结构域（k153-d280）可能与EV-D68结构蛋白复合物结合（图S4d）。为此，他们合成了包含该胞外域的Fc融合蛋白（MFSD6-Fc），并通过免疫共沉淀验证了其能有效结合EV-D68病毒颗粒（图S4e-g）。初步实验证实，MFSD6-Fc能有效抑制EV-D68的复制和进入（图S4h-r）。

随后，研究团队对这一抗病毒策略进行了升级和优化。他们将MFSD6胞外域与免疫球蛋白G（IgG）重链Fc区的第3结构域（IgG-CH3）融合，构建了重组蛋白MFSD6-Fc(CH3)（图6a）。与全长的Fc融合相比，IgG-CH3结构域能促进蛋白质二聚化，同时避免与细胞表面的Fc受体结合，从而减少潜在的副作用（如抗体依赖性增强感染）。体外实验表明，用MFSD6-Fc(CH3)预处理EV-D68病毒，能有效抑制病毒在A549细胞中引起的CPE和病毒蛋白表达（图6b， c），其机制在于阻断了病毒的附着（图6d-f）和进入过程（图6g-i），最终导致子代病毒产量大幅下降（图6j-l）。这种抑制作用在不同细胞类型（包括原代HBECs和原代星形胶质细胞）中均有效，展现了其广泛的抗病毒潜力（图6m， n）。此外，病毒RNA漂浮实验（viral RNA flotation assay）表明，MFSD6-Fc(CH3)不仅能结合病毒颗粒，还能诱导病毒脱壳（uncoating），促进病毒RNA从衣壳中释放，从而使其失去感染性（图S5g-i）。

第八步：评估MFSD6-Fc(CH3)在小鼠体内的治疗效果 最后，研究团队在一个致死性的新生小鼠EV-D68感染模型中评估了MFSD6-Fc(CH3)的体内疗效。结果显示，无论是与病毒共同孵育后感染（图6o），还是在感染前一天对小鼠进行预处理（图6p），MFSD6-Fc(CH3)都能显著保护新生小鼠，降低由EV-D68感染导致的死亡率。这为MFSD6-Fc(CH3)作为一种潜在的抗EV-D68病毒疗法提供了关键的临床前证据。

主要结果与逻辑关系 本研究的每个步骤都基于前一步的结果，逻辑链条清晰。从筛选发现MFSD6是关键宿主因子（图1），到在呼吸道等靶细胞中验证其功能必需性（图2），再到证实其作为细胞表面受体与病毒直接结合（图3），并促进病毒附着和进入（图4）。接着，通过“功能获得”实验，在非易感细胞中表达MFSD6即可重建病毒感染（图5），反向确证了其受体功能。最终，基于对MFSD6与病毒相互作用结构域的理解（AlphaFold预测），成功设计出能阻断该相互作用的工程化重组蛋白MFSD6-Fc(CH3)，并在体外和体内证明了其强大的抗病毒效果（图6， S4， S5）。这些结果层层递进，共同指向一个核心结论：MFSD6是EV-D68入侵宿主细胞的一个关键功能性受体。

结论与研究意义 本研究得出以下核心结论：1）首次鉴定出膜蛋白MFSD6是EV-D68入侵宿主细胞的关键功能性受体。2）MFSD6在细胞膜上表达，能特异性结合EV-D68病毒颗粒，并介导病毒的附着和进入过程。3）MFSD6对EV-D68原型株和当前流行株的感染均至关重要，其作用在多种人类细胞类型（包括呼吸道细胞和神经细胞）中具有保守性。4）基于此发现设计的工程化重组蛋白MFSD6-Fc(CH3)能有效阻断MFSD6与EV-D68的结合，在体外和体内模型中均展现出强大的抗病毒活性。

这项研究的科学价值在于，它揭开了EV-D68，特别是其感染呼吸道靶细胞的分子机制中的一个关键环节，深化了对该病毒致病过程的理解。研究结果挑战了传统的“一种病毒一种受体”的简单模型，因为同时期研究也提示唾液酸等其他因子是必需的（图S6k-m），暗示EV-D68的入侵可能涉及多个共受体的协同作用，这为未来的机制研究提供了新方向。此外，鉴定MFSD6作为受体，也为理解EV-D68的细胞嗜性（tropism）和潜在的神经毒性机制提供了线索。

其应用价值尤为突出。研究不仅发现了一个新的抗病毒靶点（MFSD6），更重要的是，通过结合人工智能（AlphaFold）进行结构预测和理性设计，成功开发了一种具有治疗潜力的候选药物（MFSD6-Fc(CH3)）。这种“基于受体的抗病毒策略”为应对缺乏有效疫苗和药物的EV-D68感染提供了一条创新且前景广阔的干预途径。

研究亮点 1. 重要发现：首次鉴定MFSD6为EV-D68的功能性入侵受体，填补了该病毒，特别是其呼吸道感染机制研究中的一项关键空白。 2. 方法新颖性：研究采用了从无偏向性功能筛选（基于自建的GFP报告系统）到分子机制验证（结合CRISPR、共聚焦成像、共沉淀、功能获得与缺失实验），再到治疗策略开发（基于AI结构预测的蛋白质工程）的完整研究范式，逻辑严谨，技术全面。 3. 转化潜力突出：研究并未止步于基础发现，而是成功地将其转化为一种具有明确体内外疗效的潜在抗病毒疗法（MFSD6-Fc(CH3)），实现了从基础研究到应用探索的跨越。 4. 跨学科整合：创新性地利用AlphaFold人工智能进行蛋白质结构和相互作用的预测，指导了高效抗病毒蛋白的设计，展示了交叉学科方法在生物医学研究中的强大威力。 5. 研究系统全面：研究覆盖了EV-D68的原型株和多个流行株，在多种细胞系、原代细胞（呼吸道上皮细胞和星形胶质细胞）以及动物模型中进行了验证，确保了结论的可靠性和普适性。

这项研究在病毒受体鉴定和抗病毒药物开发领域均做出了重要贡献，为应对EV-D68这一新兴公共卫生威胁提供了新的科学见解和潜在的治疗工具。