关于《Strategies for Genetically Engineering Hypoimmunogenic Universal Pluripotent Stem Cells》的学术报告

作者、机构与发表信息 本文作者为 Wei Zhao, Anhua Lei, Lin Tian, Xudong Wang, Cristina Correia, Taylor Weiskittel, Hu Li, Alan Trounson, Qiuli Fu, Ke Yao, 以及通讯作者 Jin Zhang。作者团队主要来自中国浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心、浙江大学医学院附属第二医院眼科中心、美国梅奥诊所个体化医学中心以及澳大利亚莫纳什大学和哈德森医学研究所。该综述论文发表于期刊《iScience》，时间为2020年6月26日。

论文主题与性质 本文是一篇学术综述，旨在系统性地回顾和总结在生成低免疫原性、通用型多能干细胞领域的研究进展、策略与挑战。其核心主题是探讨如何通过基因工程手段改造人多能干细胞（包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞），使其能够逃避宿主免疫系统的识别和攻击，从而为开发“即用型”的通用细胞疗法铺平道路。

论文主要观点阐述

第一，免疫不相容性是干细胞临床应用的主要障碍，而开发通用型细胞产品是解决之道。 文章开篇即指出，尽管以T细胞或干细胞疗法为代表的细胞疗法取得了进展，但免疫不相容性仍然是其临床转化的主要壁垒。同种异体移植的细胞会被宿主的免疫系统排斥。目前，基于患者自身细胞进行基因修饰的方法虽可行，但耗时且成本高昂。因此，研究焦点转向了能够使更广泛患者受益的通用型多能干细胞。人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）是导致免疫不相容的主要原因。通过HLA配型或建立iPSC库来匹配大量人群在实践和成本上面临巨大挑战。长期使用免疫抑制剂则会带来严重的副作用。因此，通过基因编辑技术改造移植细胞的基因组，降低其免疫原性，实现大规模生产“即用型”细胞产品，成为一种极具前景的新策略。

第二，降低免疫原性的策略可分为两大类：利用免疫抑制机制和编辑HLA基因。 文章的主体部分详细阐述了两种核心策略。第一种策略是利用天然的免疫抑制机制。这一思路源于对胎盘和癌细胞免疫逃逸现象的观察。例如，胎盘滋养层细胞通过低表达MHC分子（HLA在人类中的对应物）和高表达CD47等分子来保护胎儿免受母体免疫攻击。癌细胞则通过表达CTLA-4、PD-L1、CD47等免疫检查点分子来抑制T细胞、NK细胞和巨噬细胞的活性。研究表明，在多能干细胞中过表达这些免疫抑制分子（如CTLA4-Ig融合蛋白、PD-L1、CD47），可以部分保护工程化细胞免受同种异体宿主的免疫攻击。例如，Rong等人将CTLA4-Ig或PD-L1敲入hESCs，发现修饰后的细胞能有效抑制T细胞活性。Deuse等人发现过表达CD47能帮助细胞逃避NK细胞和巨噬细胞的攻击。这种策略不涉及内源基因的敲除，可能具有较低的脱靶效应风险，但其免疫保护效果可能不全面，且外源表达的潜在副作用需进一步评估。

第二种策略是直接编辑HLA基因以逃避适应性免疫攻击。这又分为针对HLA I类分子和II类分子的编辑。 * 编辑HLA I类基因以逃避CD8+ T细胞攻击：HLA I类分子几乎在所有有核细胞表面表达，负责向CD8+ T细胞呈递抗原。通过敲除其必要组分β2微球蛋白（β2m）基因，可以大幅降低细胞表面的HLA I类分子表达，从而避免被同种异体CD8+ T细胞识别。然而，HLA I类分子的缺失会触发NK细胞的“missing self”（丢失自我）反应，导致NK细胞攻击这些“自我标记”缺失的细胞。 * 应对NK细胞攻击的策略：为了解决因敲除HLA I类分子引发的NK细胞攻击，研究者采取了不同策略： 1. 在敲除β2m的同时，过表达非经典HLA分子如HLA-E，以抑制表达NKG2A受体的NK细胞亚群（Gornalusse等人，2017）。 2. 选择性敲除经典的、高多态性的HLA-A和HLA-B基因，而保留具有抑制NK细胞功能的HLA-C基因（Xu等人，2019）。 3. 敲除所有经典HLA I类基因（HLA-A/B/C），同时过表达HLA-G来抑制包括KIR2D+亚群在内的NK细胞（Han等人，2019）。 * 编辑HLA II类基因以逃避CD4+ T细胞攻击：HLA II类分子主要存在于抗原呈递细胞表面，负责激活CD4+辅助T细胞。通过敲除其主调控因子CIITA，可以抑制HLA II类分子的表达。Deuse等人的研究表明，与仅敲除HLA I类相比，HLA I类和II类双敲除的小鼠iPSCs能更有效地逃避免疫攻击，形成畸胎瘤的比例更高。这证明HLA II类缺陷能进一步增强移植细胞的低免疫原性。但需注意，若最终分化的细胞产品是树突状细胞等专职抗原呈递细胞，敲除HLA II类分子会损害其功能。

第三，综合性的基因工程策略是生成强效低免疫原性多能干细胞的当前方向。 近期研究趋向于采用组合策略，同时针对多种免疫排斥途径进行工程化改造，以实现更全面的免疫逃避。文章重点介绍了三项代表性研究： 1. Deuse等人（2019）的策略：敲除β2m和CIITA以消除HLA I类和II类介导的T细胞反应，同时过表达CD47以抑制先天免疫细胞（NK细胞和巨噬细胞）的攻击。 2. Xu等人（2019）的策略：选择性敲除HLA-A、HLA-B和CIITA，但保留HLA-C基因。保留的HLA-C可以抑制部分NK细胞，而敲除的HLA-A/B则避免了强烈的T细胞反应。然而，保留的HLA-C仍可能呈递抗原给T细胞。 3. Han等人（2019）的策略：这是一种更为全面的方法。同时敲除了所有经典HLA I类基因（HLA-A/B/C）和CIITA（消除HLA II类），以彻底逃避免疫适应性免疫。同时，引入了三种免疫调节因子：过表达PD-L1以抑制T细胞，过表达HLA-G以抑制NK细胞，过表达CD47以抑制巨噬细胞的吞噬作用。体外实验表明，这种工程化细胞能显著降低T细胞和NK细胞的活化水平。

文章通过图表（Figure 1 & 2）清晰地对比了这些策略，说明了它们如何分别或联合应对T细胞、NK细胞和巨噬细胞的攻击。

第四，评估低免疫原性需要结合体外和体内实验模型，且模型在不断进化。 文章系统总结了评估基因工程干细胞低免疫原性的方法。体外实验是基础，包括： * 分子水平验证：使用定量PCR和流式细胞术检测HLA基因敲除或免疫分子表达的效率。 * 功能学验证： * T细胞反应：进行T细胞增殖实验、活化标志物检测以及细胞毒性实验，评估工程化细胞抑制同种异体T细胞反应的能力。 * NK细胞反应：通过共培养实验，检测NK细胞的活化标志物（如CD107a）或杀伤能力。 * 巨噬细胞吞噬：使用pH敏感性荧光染料标记靶细胞，与巨噬细胞共培养后，通过检测荧光强度来量化吞噬作用。

然而，体内评估至关重要。文章概述了用于低免疫原性测试的动物模型的演进（Figure 3）： 1. 免疫健全同种异体小鼠模型：用于测试修饰后的小鼠细胞。通过测量移植后畸胎瘤的生长情况来评估免疫逃避效果。 2. 免疫缺陷小鼠模型：如NSG或NRG小鼠，它们缺乏T、B、NK细胞。研究人员可以将工程化的人源细胞与活化的人源T细胞一同注射到这些小鼠体内，观察细胞存活或畸胎瘤形成情况，以模拟人T细胞的攻击。 3. 人源化小鼠模型：这是更先进的模型，通过将人造血干细胞或胎儿肝、胸腺组织移植到免疫缺陷小鼠体内，重建人类免疫系统。然后将工程化的人源细胞移植到这些人源化小鼠中，可以更真实地模拟工程化细胞与人类免疫微环境的相互作用。例如，Deuse等人将工程化细胞移植到BLT人源化小鼠（移植了人胎儿肝、胸腺和CD34+ HSC的NSG小鼠）中，成功证明了其细胞能在具有功能性人类免疫系统的环境中存活。

第五，开发通用型多能干细胞仍面临诸多挑战，安全性是核心关切。 尽管前景广阔，文章明确指出该领域仍存在重大挑战： * 安全性问题：多次基因编辑可能增加脱靶风险。多能干细胞本身在培养过程中就可能积累致癌突变（如TP53基因突变）。更令人担忧的是，完全消除MHC（HLA）可能模拟某些传染性癌症（如袋獾面部肿瘤病）的免疫逃逸机制，理论上存在细胞产品在宿主体内不受控增殖甚至传播的风险。因此，对工程化细胞及其分化后代进行严格的基因组突变筛查至关重要。 * 安全措施：一种潜在的安全解决方案是在修饰的iPSCs中引入“自杀基因”。例如，将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因或可诱导的Caspase-9基因置于干细胞特异性启动子下游。一旦移植细胞出现异常增殖，可以通过给予特定药物（如更昔洛韦或小分子二聚化剂）来选择性清除这些细胞。 * 功能丧失问题：敲除MHC分子会导致细胞失去抗原呈递功能。这对于大多数治疗性细胞（如心肌细胞、神经元）可能不是问题，但对于旨在用于肿瘤疫苗的树突状细胞等产品则是致命缺陷。文章提出了可能的解决方案：1）开发“半同种异体”策略，保留部分与受体匹配的MHC位点；2）不敲除MHC，而是充分激活免疫抑制机制（如过表达多个免疫调节基因）来实现低免疫原性，同时保留抗原呈递功能。 * NK细胞抑制的复杂性：由于NK细胞亚群具有异质性，表达不同的抑制性受体（如KIRs和NKG2A），它们分别被不同的HLA分子（如HLA-C、HLA-G、HLA-E）抑制。因此，过表达单一的HLA分子（如HLA-E或HLA-G）可能无法抑制所有NK细胞亚群。如何实现对NK细胞全面、有效的抑制仍需深入研究。

第六，论文的意义与价值 这篇综述论文具有重要的学术价值和指导意义。它不仅仅是对现有文献的罗列，而是进行了系统的梳理、比较和综合。首先，文章清晰地勾勒出了从利用免疫抑制机制到编辑HLA基因，再到综合性策略这一领域发展的技术路线图，帮助读者把握该领域的演进逻辑。其次，文章详细对比了不同研究团队策略的异同、优劣和潜在问题（如应对NK细胞的不同方法），为后续研究者选择或设计技术方案提供了宝贵的参考。第三，文章系统总结了从分子表型到细胞功能，从体外实验到体内复杂模型的评估体系，为如何严谨地证明“低免疫原性”设立了方法学标准。最后，文章没有回避挑战，而是深入探讨了安全性、功能保留等关键瓶颈问题，并指出了未来的研究方向（如半同种异体策略、保留MHC的免疫抑制策略），对推动该领域从基础研究向安全、有效的临床转化具有前瞻性的指导作用。

本文是一篇关于通用型低免疫原性多能干细胞研究领域的深度综述。它全面阐述了该领域的研究背景、核心策略、评估方法和现存挑战，为相关领域的研究人员提供了清晰的知识框架和深入的技术见解，是理解这一前沿热点领域的重要参考文献。