关于泰国成人慢性牙周炎患者中伴放线聚集杆菌血清型和DGGE亚型分布的研究报告

一、 研究作者、机构及发表信息

本研究的主要作者团队包括Nuntiya Pahumunto, Praphansri Ruangsri, Mutita Wongsuwanlert, Supatcharin Piwat, Gunnar Dahlen以及通讯作者Rawee Teanpaisan。研究机构主要来自泰国宋卡王子大学牙科学院的口腔疾病与流行病学研究中心、口腔内科系、牙体牙髓病科以及预防牙科系，同时还有来自瑞典哥德堡大学萨赫尔格雷斯卡学院口腔微生物与免疫学系的合作者。

该研究以题为“Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotypes and DGGE subtypes in Thai adults with chronic periodontitis”的论文形式，发表于《Archives of Oral Biology》期刊。文章于2015年3月3日收到，同年9月2日修订，并于9月3日被接受。本文所提供的版本是已被期刊接受但尚未进行最终排版编辑的手稿PDF。

二、 研究的学术背景与目的

本研究属于口腔微生物学与牙周病学交叉领域，聚焦于牙周炎关键病原菌之一——伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa）。Aa是一种革兰阴性、嗜二氧化碳的球杆菌，与侵袭性及慢性牙周炎的发生发展密切相关。传统上，Aa可根据其表面多糖抗原分为至少六种血清型（a-f）。不同血清型与疾病的关系存在差异，例如，血清型b在侵袭性牙周炎（特别是青少年牙周炎）患者中比例较高，而血清型a和c则更多与牙周健康相关。此外，一种具有高毒力的JP2克隆（其白细胞毒素基因启动子区存在530 bp的缺失）被归类为血清型b，并且据报道主要在非洲裔人群中流行。并非所有的Aa菌株都能被血清分型，非血清可分型菌株的存在已被报道，且在亚洲人群中的比例似乎更高。

先前关于Aa血清型分布的研究大多集中在白种人、西班牙裔或非裔美国人群体，针对亚洲人群，特别是泰国成年慢性牙周炎患者的数据相对有限。此外，传统的血清分型方法可能无法完全揭示Aa菌群的多样性，尤其是对于非血清可分型菌株。变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）作为一种分子指纹图谱技术，已被用于检测牙菌斑中的微生物，包括Aa，但尚未被广泛用于对Aa非血清可分型菌株进行亚型分型。

基于以上背景，本研究旨在调查泰国成年慢性牙周炎患者中，Aa的流行率、血清型分布情况，并首次应用DGGE技术对Aa菌株（特别是非血清可分型菌株）进行亚型分型，以期更深入地了解该人群Aa菌群的多样性、分布特征及其与牙周状况的潜在关联。

三、 研究的详细工作流程

本研究的设计和实施包含以下几个关键步骤：

1. 研究人群与临床检查： 研究连续招募了44名被诊断为广泛性中重度慢性牙周炎的泰国成年患者。所有患者均接受了全面的口腔临床检查，记录全口牙齿的临床附着丧失（Clinical Attachment Level, CAL）、牙周探诊深度（Probing Pocket Depth, PPD）和探诊后出血（Bleeding on Probing, BOP）情况。患者的平均年龄为46.4岁，男性占45.5%，吸烟者占23.3%。临床参数显示，患者平均有35.3%的位点CAL≥4 mm，19.3%的位点PPD≥5 mm。

2. 龈下菌斑采样： 从每位患者随机选取两个位点采集龈下菌斑样本。第一个样本来自一个深牙周袋位点（定义为CAL≥4 mm，PPD≥5 mm，且BOP阳性）。第二个样本来自一个浅牙周袋/健康位点（无CAL，无BOP，且PPD≤3 mm）。采样使用无菌纸尖，放入还原输送培养基中，并立即送往实验室。

3. Aa的分离培养与鉴定： 样本在选择性TSBv琼脂培养基上，于厌氧条件下培养3-5天，以分离Aa。通过典型的菌落形态（星形或光滑小菌落、粘附性强、过氧化氢酶阳性）和革兰染色（革兰阴性球杆菌）进行初步鉴定。所有分离株均通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）检测白细胞毒素基因（*ltx*）的存在以进行最终确认。共分离出184株Aa阳性菌落（145株来自深袋，39株来自浅袋）。研究中还使用了包括各血清型参考菌株以及JP2克隆菌株在内的对照菌株。

4. 白细胞毒素基因分析： 使用特异性引物（ltx3和ltx4）通过PCR扩增*ltx*基因启动子区，以鉴定是否存在JP2克隆特有的530 bp缺失或文中所述的886 bp插入。正常启动子扩增产物为1216 bp，缺失型为686 bp，插入型为2117 bp。

5. 血清分型： 所有Aa分离株的DNA提取后，采用多重PCR方法，使用针对各血清型（a-f）的特异性引物进行血清分型。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的大小来确定血清型。

6. DGGE亚型分型： 对所有的Aa分离株进行DGGE分型。该方法扩增16S rRNA基因的V2-V3区，使用带GC夹的引物Hda1-GC和Hda2。PCR产物在35%至60%的变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳。通过比较临床菌株与参考血清型菌株的条带模式，并使用Bionumerics软件进行聚类分析（采用Dice相似系数和UPGMA方法），将菌株划分为不同的DGGE亚型。

7. 数据分析与菌株界定： 在数据分析中，关键的一步是界定“独立菌株”。来自同一患者同一采样点的多个菌落，如果具有相同的血清型和DGGE亚型，则被视为同一菌株。最终，从79个深袋样本和17个浅袋样本中，共获得了96个独立菌株用于后续分析。统计方法上，使用卡方检验比较深袋和浅袋位点间Aa血清型频率的差异。

四、 研究的主要结果

1. Aa的流行率： 在44名患者中，有37名（84.1%）检测到Aa。从深牙周袋位点分离出79株独立菌株，从浅牙周袋位点分离出17株。深袋的Aa检出率显著高于浅袋。

2. 血清型分布： 在患者水平上，携带血清可分型菌株和非血清可分型（Non-Serotypeable, NS）菌株的患者比例相同，均为54.5%。在可血清分型的菌株中，血清型a（18.2%）和c（15.9%）最为常见，其次是血清型f（11.4%）和e（9.1%）。令人注意的是，本研究未检测到血清型b和d。特别重要的发现是，两株具有JP2克隆类似特征（*ltx*启动子区530 bp缺失）的菌株，以及另外两株在*ltx*启动子区具有886 bp插入的菌株，均被鉴定为血清型c。非血清可分型菌株在深袋来源的菌株中比例（69.2%）显著高于浅袋来源的菌株（29.4%）。

3. DGGE亚型分析结果： DGGE成功地将所有菌株分为不同的亚型。24株血清可分型菌株归为3个DGGE亚型（S1-S3）：S1亚型包含血清型a、d、f（DGGE未能区分这三者），S2亚型对应血清型c，S3亚型对应血清型e。更为重要的是，60株非血清可分型菌株被进一步细分为16个不同的DGGE亚型（NS1-NS16），显示了极高的亚型多样性。其中，NS1和NS2亚型最为常见（分别占深袋菌株的12.7%和10.1%）。聚类分析显示，DGGE亚型与血清型分类并非完全一致。

4. 多位点亚型共存现象： 研究发现，同一个深牙周袋内可以共存多种Aa亚型。大多数患者（32.4%）仅携带一种亚型，但有29.7%的患者携带2种，29.7%的患者携带3种，甚至有8.1%（3名患者）的深袋样本中同时存在多达4种不同的Aa亚型（包括血清型和DGGE亚型）。这揭示了牙周袋内Aa菌群的高度复杂性。

5. JP2样菌株与插入型菌株的临床特征： 携带JP2样菌株（血清型c）的两名患者，以及携带*ltx*启动子插入型菌株（血清型c）的另外两名患者，其临床诊断均为广泛性中重度慢性牙周炎。数据显示，携带JP2样菌株的患者牙周破坏指标（如PPD≥5 mm和≥7 mm的位点百分比）似乎更高，但样本量小，需谨慎解读。

五、 研究的结论与意义

本研究得出结论：在泰国成年慢性牙周炎患者中，Aa的流行率很高（84.1%），并且其亚型多样性，尤其是非血清可分型菌株的多样性，远高于以往在亚洲或其他人群中的报道。非血清可分型菌株与血清可分型菌株同样普遍，并且与深牙周袋显著相关，提示某些特定的非血清可分型DGGE亚型（如NS1和NS2）可能与疾病活动性有关。

研究的科学价值在于： 1. 提供了泰国人群Aa流行病学新数据： 首次系统报道了泰国成年慢性牙周炎患者中Aa的血清型和基于DGGE的亚型分布，填补了该地区数据的空白。 2. 揭示了独特的菌株特征： 首次发现并报道了具有JP2克隆类似基因缺失特征（530 bp缺失）以及新型基因插入特征（886 bp插入）的Aa菌株被鉴定为血清型c，这挑战了JP2高毒力克隆仅与血清型b相关的传统认知，表明毒力基因变异可能跨越血清型界限。 3. 拓展了分型方法的应用： 成功地将DGGE技术应用于Aa非血清可分型菌株的亚型分型，证明该方法能有效揭示传统血清分型所掩盖的菌株高度多样性，为未来研究Aa的种群结构和微进化提供了新工具。 4. 揭示了口腔微生态的复杂性： 发现同一牙周袋内可共存多达4种Aa亚型，强调了牙周病原体在局部生态位中可能存在复杂的菌株间相互作用和生态位分割，这对理解牙周病的发病机制和个性化治疗具有启示意义。

应用价值在于，对特定人群（如亚洲人）中优势Aa亚型（特别是非血清可分型及特定DGGE亚型）的认识，可能有助于未来开发更有针对性的诊断方法或预防策略。同时，发现新的毒力基因变异型（血清型c背景下的缺失/插入型）提示需要进行后续的毒力功能研究，以评估其临床重要性。

六、 研究的亮点

1. 高比例的非血清可分型菌株： 在泰国患者中，非血清可分型Aa菌株的比例异常高（54.5%），与血清可分型菌株持平，提示该人群可能存在独特的Aa菌群结构。
2. 毒力基因变异的血清型新发现： 首次报道了具有JP2样特征（*ltx*启动子530 bp缺失）和新型插入（886 bp插入）的菌株属于血清型c，而非传统的血清型b，这是一个重要的新发现。
3. DGGE揭示的高多样性： 首次应用DGGE对Aa非血清可分型菌株进行分型，发现了16种不同的亚型，极大地拓展了对该菌种内多样性的认知。
4. 牙周袋内菌株的高度异质性： 在同一深牙周袋内检出多达4种Aa亚型，直观展示了牙周病原体在病灶部位的微多样性，这是以往基于单一菌落或混合样本的分子检测方法容易忽略的细节。

七、 其他有价值的内容

本研究还通过详细的临床参数描述了患者群体的特征，并将细菌学发现与临床指标（如深袋与浅袋）进行了关联分析，增强了结果的临床相关性。作者在讨论部分，将本研究结果置于全球不同地理和种族人群研究的背景下进行比较，深入探讨了检测方法（培养、PCR、棋盘杂交）对流行率结果的影响，以及可能解释非血清可分型菌株优势的生态学假说（如适应性竞争），显示了研究的深度和广度。此外，研究明确指出了样本量较小可能限制了对某些不常见血清型（如b和d）检出能力的局限性，体现了科学报告的客观性。