本研究由肖振宇（Zhenyu Xiao，北京理工大学）、公彦栋（Yandong Gong，中国人民解放军总医院/昆明理工大学）、杨晓龙（Xiaolong Yang，北京理工大学）、何南南（Nannan He，郑州大学第一附属医院）等人共同完成，通讯作者为肖振宇、刘兵（Bing Liu，中国人民解放军总医院/昆明理工大学/天津医科大学）和兰雨（Yu Lan，中国医学科学院血液病医院/天津健康科学研究院）。该研究成果以《Epiblast diversification and blood formation in a human pregastrula》为题，于2026年发表于《自然》（Nature）期刊。
一、 研究背景与目标
本研究聚焦于人类胚胎发育中一个关键但尚未被深入探索的时期：原肠胚形成（gastrulation）的初始阶段，即原条（primitive streak）即将出现之前，对应于卡内基分期第6期（Carnegie Stage 6, CS6，约受精后13-14天）。原肠胚形成是胚胎建立身体三个主要轴线（前后轴、背腹轴、左右轴）并形成三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层）的关键事件。然而，在此之前，胚胎的细胞如何开始分化、最早的血液细胞如何产生，在人类中仍不明确。
在模式动物（如小鼠）中，已知存在一个称为“组织者”（organizer）的信号中心（如小鼠的前内脏内胚层，anterior visceral endoderm, AVE），它对于正确建立前后轴至关重要。此外，最早的血液生成（原始造血，primitive haematopoiesis）被认为始于原肠胚形成之后，由原肠胚形成产生的外胚层中胚层（extra-embryonic mesoderm）在卵黄囊（yolk sac）中产生。然而，在人类中，这些早期事件的发生时间、细胞起源和空间特征仍存在许多未知。例如，人类最早的血液细胞究竟是起源于下胚层（hypoblast）还是上胚层（epiblast）？原始造血是否在原肠胚形成之前就已启动？
因此，本研究旨在利用高分辨率空间转录组学技术，绘制人类CS6期胚胎（原肠胚形成前）的分子和细胞图谱，以期揭示：（1）上胚层在原肠胚形成前的分化轨迹；（2）人类原始造血的起始时间、细胞起源和空间调控机制。
二、 详细研究流程
本研究是一项基于单一样本的深度空间转录组学分析，其核心流程如下：
1. 样本获取与处理： 研究人员从一位健康孕妇（自愿终止妊娠并知情同意）处获得了一个完整的人类胚胎。通过形态学评估（胚胎盘直径约1毫米，未见原条、原结或原沟），结合受孕日期估算和生物信息学比较，该胚胎被精确鉴定为CS6期（约受精后13-14天）。样本在PBS中清洗后，进行冷冻包埋（OCT包埋），并使用冷冻切片机连续切割成49张厚度为10微米的矢状面切片，切片平均间距约为20微米。
2. 空间转录组测序与数据生成： 研究采用了Stereo-seq（Spatiotemporal Enhanced Resolution Omics-sequencing）技术对胚胎切片进行空间转录组分析。这是一种基于DNA纳米球（DNA nanoballs, DNBs）的高分辨率空间定位测序技术，空间分辨率可达500纳米。具体步骤包括：将组织切片置于Stereo-seq芯片上，进行甲醇固定和透化处理；芯片上的DNBs捕获从组织中释放的RNA；通过逆转录合成cDNA；构建测序文库并进行高通量测序。经过质量控制、序列比对（使用STAR软件比对到人类基因组hg38）和基因注释，最终生成了一个包含228,028个有效检测点（spot，对应15微米 x 15微米区域）的空间基因表达矩阵。
3. 数据处理与细胞类型注释： 利用Seurat等生物信息学软件包对表达矩阵进行预处理（质量控制、去除线粒体和核糖体基因影响）。为了整合所有切片的数据并构建三维模型，研究使用了SLAT算法对49张切片进行空间对齐，为每个检测点赋予三维坐标。通过无监督降维（如UMAP）和聚类分析，研究人员根据经典标记基因、功能富集模式和空间位置，将整个胚胎的细胞注释为5个主要谱系（上胚层、下胚层、羊膜、卵黄囊和胎盘滋养层），并进一步细分为19个亚群。这一步骤建立了CS6胚胎的全面转录组特征图谱。
4. 上胚层发育轨迹分析： 研究聚焦于上胚层的4个亚群（Epi1-Epi4）。为了解析它们之间的发育关系，研究人员结合了羊膜外胚层（amnionic ectoderm, am.ecto）和羊膜（amnion, am）细胞（已知羊膜起源于上胚层），进行了伪时间（pseudotime）分析（使用Slingshot、Monocle3等算法）。同时，利用CytoTRACE2和干性评分（stemness score）评估了各亚群的分化潜能。为了探索Epi1亚群的发育连续性，研究人员将本研究的CS6数据与已发表的CS7期（早期和晚期）和CS8期人类胚胎空间或单细胞转录组数据集进行了整合分析，比较了上胚层、轴旁中胚层（axial mesoderm，包括节点/脊索前板/脊索）和原肠胚形成来源的中胚层细胞。
5. 造血相关细胞鉴定与起源探索： 从注释的细胞中，研究人员进一步聚焦于血液细胞及其转录组邻近的细胞，鉴定出12个亚群，包括连接蒂（connecting stalk）、下胚层、3个卵黄囊内胚层（yolk sac endoderm, ys.endo）簇、2个卵黄囊外胚层中胚层（yolk sac extra-embryonic mesoderm, ys.exmc）簇和5个造血细胞簇。通过分析这些细胞的标记基因和空间分布，确定了原始红细胞（primitive erythroid, pery）、原始巨核细胞（primitive megakaryocytic, pmeg）和原始髓系前体细胞（primitive myeloid precursors, pmp）的存在。 为了追溯这些造血谱系的起源，研究人员进行了多种轨迹预测分析（如RNA velocity、PAGA、Monocle3），比较了上胚层和下胚层各亚群与造血细胞/ys.exmc的转录组相似性和发育路径可能性。同时，通过计算命运偏向（FateID）和基因集评分，评估了不同ys.exmc亚群的谱系分化潜能。
6. 空间微环境与细胞互作分析： 基于三维空间位置信息，研究使用多种空间域识别算法（如SPIN、Banksy、STAGATE、GraphST）来识别卵黄囊内的不同功能区域。通过细胞-细胞相互作用分析（基于配体-受体对），探索了不同空间区域内细胞群之间的信号通讯网络，以揭示调控不同造血谱系生成的微环境线索。
7. 跨阶段整合与功能验证： 为了理解CS6期发现的造血祖细胞（pmp）与后续发育阶段细胞的关系，研究人员将CS6数据与已发表的CS7期人类胚胎单细胞数据进行了整合分析，追踪了pmp到CS7期原始巨噬细胞（primitive macrophages）的发育轨迹。通过比较CS6的pmp与CS7期已知的卵黄囊来源的髓系偏向多能祖细胞（yolk sac-derived myeloid-biased multipotent progenitors, YSMPs）在代谢特征、信号通路活性和基因表达谱上的差异，阐明了它们不同的功能状态和发育命运。
三、 主要研究结果
1. 构建了人类CS6期胚胎的高精度空间转录组图谱： 研究成功绘制了包含胚胎盘、羊膜囊、卵黄囊、连接蒂和绒毛膜板在内的完整CS6胚胎的空间基因表达图谱。共鉴定出19个细胞亚群，并构建了其三维空间分布模型。细胞周期分析显示，胚胎细胞比胚外细胞具有更高的增殖活性。
2. 揭示了上胚层在原肠胚形成前的三分化轨迹： 伪时间分析表明，CS6期的上胚层存在三条明确的分化轨迹，均起源于一个相对未分化的状态（Epi3亚群）： * 路径一（Path 1）：从Epi3经Epi2向Epi1分化。Epi1高表达多种脊椎动物组织者标志基因（如GSC, LHX1, CHRD, NOTO, FOXA2），其基因富集于模式形成、区域化以及纤毛运动和运动纤毛特性相关通路。与CS7/CS8期人类胚胎数据整合分析发现，Epi1在转录组上与后续发育阶段（CS7/CS8）的节点/脊索前板/脊索（轴向中胚层）细胞高度相似，但在空间上更靠前。这表明Epi1可能代表了轴向中胚层（axial mesoderm）的雏形，提示人类胚胎在原肠胚形成开始前，上胚层内部可能已经存在预先的轴向特化。 * 路径二（Path 2）：从Epi3经羊膜外胚层（am.ecto）向羊膜（am）分化，这与已知的羊膜发育路径一致。 * 路径三（Path 3）：从Epi3向Epi4分化。Epi4的功能特征有待进一步研究。 此外，研究还鉴定了一个具有AVE样特征的下胚层群体，提示其在人类早期轴向建立中可能发挥类似小鼠AVE的作用。
3. 首次发现人类原始造血在原肠胚形成前即已启动： 在CS6期胚胎的卵黄囊中，研究人员鉴定出了所有三种原始造血谱系的细胞：原始红细胞（pery1）、原始巨核细胞（pmeg1）和原始髓系前体细胞（pmp）。这一发现将人类原始造血的起始时间从之前认为的CS7期（约16-19天）提前到了CS6期（约13-14天），即在形态学可见的原条出现和原肠胚形成开始之前。
4. 明确了最早血细胞起源于下胚层来源的胚外中胚层： 轨迹分析和转录组相似性比较均强烈支持，CS6期的造血细胞和卵黄囊外胚层中胚层（ys.exmc）更可能起源于下胚层（hypoblast），而非上胚层（epiblast）。这一发现挑战了“最早血细胞起源于上胚层”的现有范式，为人类原始造血的细胞起源提供了直接证据。
5. 揭示了卵黄囊内两个空间区域分别支持不同造血谱系的生成： 研究在卵黄囊内识别出两个在转录组和空间上均截然不同的区域，各自由分子特征不同的内胚层和中胚层细胞群组成： * 区域A（近端后部区）：包含ys.exmc1和pmp。ys.exmc1高表达髓系发育相关基因（如GATA2, LMO2, MPO），计算预测显示其具有更高的髓系分化潜能。该区域内的细胞互作分析提示，Hedgehog信号通路可能参与早期髓系分化。 * 区域B（远端前部区）：包含ys.exmc2、pery1和pmeg1。ys.exmc2高表达红细胞和巨核细胞发育相关基因（如HBE1, PF4），并富集于应对缺氧、氧化应激和视黄酸（retinoic acid）反应等通路，计算预测显示其具有更高的红系-巨核系分化潜能。该区域内存在强烈的视黄酸和促红细胞生成素（EPO）信号从ys.endo3传递至ys.exmc2和pery1，以及蛋白酶激活受体（PAR）信号从ys.endo3传递至pmeg1，这些信号可能分别促进红细胞生成和巨核细胞分化/成熟。 这一发现表明，人类最早的髓系和红系-巨核系造血发生在卵黄囊的不同空间微环境中，受到局部信号网络的精确调控。
6. 阐明了原始髓系前体细胞（pmp）向巨噬细胞/小胶质细胞分化的路径： 通过整合CS6和CS7数据，研究发现CS6期的pmp是CS7期出现的原始巨噬细胞的直接前体。pmp已经表达了一些巨噬细胞分化相关基因（如C1QA, CD86），并且与后续发育阶段（CS11-CS17）的髓系祖细胞相比，显示出更高的巨噬细胞特征评分。沿着pmp向巨噬细胞分化的轨迹，基因表达动态显示，pmp最终产生的巨噬细胞已开始表达小胶质细胞（microglia）特征基因（如CX3CR1, P2RY12），提示最早的卵黄囊巨噬细胞在起源部位就已具有向小胶质细胞分化的倾向。
四、 研究结论与意义
本研究通过高分辨率空间转录组学，首次系统描绘了人类原肠胚形成前（CS6期）胚胎的细胞和分子图谱，并取得了以下突破性结论： 1. 人类上胚层在原肠胚形成前已存在预先的轴向特化，其中一条分化轨迹指向节点/脊索前板/脊索（轴向中胚层）的雏形，提示脊椎动物轴向建立的机制在人类早期发育中可能是保守的。 2. 人类原始造血起始时间早于原肠胚形成，在CS6期（约13-14天）的卵黄囊中即已存在红系、巨核系和髓系三种血细胞。 3. 人类最早的血细胞起源于下胚层来源的胚外中胚层，而非上胚层。 4. 最早的造血发生具有明确的空间分区性：卵黄囊近端后部区域主要支持髓系生成，而远端前部区域主要支持红系-巨核系生成，不同区域受到特异的信号网络调控。 5. 最早的原始髓系前体细胞（pmp）是后续巨噬细胞的直接来源，并且这些巨噬细胞已具备向小胶质细胞分化的分子特征。
科学价值：本研究重塑了对于人类胚胎最早细胞命运决定和造血起始的认识。它揭示了原肠胚形成前胚胎的复杂性和高度组织性，将关键发育事件（如轴向特化和造血起始）的时间点大幅提前，并明确了其独特的细胞起源和空间调控模式。这些发现为理解人类早期发育的独特性提供了关键数据。
应用价值：本研究产生的CS6期胚胎高精度空间转录组数据，为优化和评估体外培养的人类胚胎模型（如类胚胎模型）以及干细胞分化体系（如造血分化）提供了至关重要的“金标准”参考。有助于推动更精准地模拟人类早期发育事件，特别是在伦理限制下无法研究的原肠胚形成早期阶段。
五、 研究亮点
六、 其他有价值内容
研究还通过与小鼠、猴等模式动物的数据进行比较，揭示了物种间发育的保守性与差异性。例如，CS6人类胚胎中发现的Epi1亚群与小鼠E6.5期的节点细胞在转录组上具有相似性。同时，研究也指出了当前体外培养系统（受14天伦理限制）的局限性，它们无法重现CS6期胚胎中观察到的Epi1和卵黄囊造血，从而凸显了本项体内研究数据的不可替代性。这些发现为进化发育生物学研究和体外模型优化提供了重要线索。