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本研究由胡亚玲（yaling hu）、刘爽（shuang liu）、刘文媛（wenyuan liu）、张子源（ziyuan zhang）、刘宇翔（yuxiang liu）、李素芬（sufen li）、孙大林（dalin sun）、张光（guang zhang）和方敬爱（jingai fang）等人共同完成。第一作者胡亚玲来自山西医科大学（shanxi medical university）及山西医科大学第一医院肾病科（department of nephrology, first hospital of shanxi medical university），通讯作者方敬爱同样来自山西医科大学第一医院肾病科。该研究发表于《diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy》期刊，2022年第15卷，943–962页，出版日期为2022年3月29日。

本研究属于糖尿病肾病（diabetic nephropathy, dn）治疗领域的网络药理学（network pharmacology）与分子对接（molecular docking）研究，并结合体外和体内实验验证。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，可进展为终末期肾病，严重影响患者健康与生活质量。目前临床治疗以控制血糖、血压、改善微循环等为主，但疗效仍不理想。中医药因其多靶点、多层次、副作用少的优势，在糖尿病肾病治疗中日益受到关注。益肾胶囊（yishen capsule）是由黄芪、当归、芡实、泽泻、五味子、红景天等中药组成的医院制剂，具有补肾益气、利尿消肿、活血化瘀及调节免疫等功效。既往研究已初步证实益肾胶囊可改善糖尿病肾病大鼠肾功能、减轻足细胞损伤、抑制炎症和纤维化，但其具体分子机制尚不完全清楚。网络药理学能够系统整合药物成分与疾病靶点信息，为中药复方多成分、多靶点、多通路的作用机制研究提供新思路。因此，本研究旨在通过网络药理学和分子对接方法筛选益肾胶囊治疗糖尿病肾病的关键活性成分、核心靶点和信号通路，并通过体外和体内实验对关键通路靶点进行验证，以揭示益肾胶囊治疗糖尿病肾病的潜在分子机制。

本研究的工作流程包括网络药理学分析、分子对接验证、动物实验和细胞实验四个主要部分。在网络药理学分析中，作者首先利用tcmsp数据库获取益肾胶囊中六味中药的全部化学成分，并根据口服生物利用度（oral bioavailability, ob）≥30%和类药性（drug-likeness, dl）≥0.18的标准进行初步筛选，同时结合tcmid数据库和已发表文献补充未预测到的活性成分及已报道靶点，再通过uniprot数据库筛选并标准化人源靶点。结果显示共获得53个活性成分，其中黄芪20个、当归7个、芡实1个、泽泻7个、五味子8个、红景天10个，去除重复后共获得516个药物作用靶点。糖尿病肾病疾病靶点从genecards、omim、ttd、disgenet和drugbank数据库获取，合并去重后共得到1324个疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，得到150个共同靶点，并绘制韦恩图（venn diagram）。随后将交集靶点提交至string11.0平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, ppi）网络，并利用cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。以度值（degree）≥中位数2倍为阈值，筛选出26个核心网络蛋白，包括stat3、tp53、akt1、jak2、mapk1、jun、tnf、vegfa等。接着使用metascape平台进行go（gene ontology）和kegg（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，显著性标准设为p<0.01。共筛选出255个显著相关的生物学过程（biological process, bp）、74个细胞组分（cellular component, cc）和96个分子功能（molecular function, mf）。kegg富集分析得到159条主要信号通路，主要包括age-rage信号通路、pi3k-akt信号通路、hif-1信号通路、jak-stat信号通路和胰岛素信号通路等。作者进一步利用cytoscape 3.7.2构建“益肾胶囊成分-糖尿病肾病靶点-通路”网络图，共包含586个节点和1748条关系。通过分析网络拓扑参数，预测槲皮素（quercetin）为益肾胶囊治疗糖尿病肾病的主要活性成分，山柰酚（kaempferol）、没食子酸（epigallocatechin gallate）和黄芪甲苷iv（astragaloside iv）为次要成分；ptgs2为主要靶点，ar、akt1、nos2等为次要靶点。将网络分析得到的核心靶点与ppi网络核心靶点取交集，最终获得10个关键靶点：ar、akt1、tp53、esr1、jun、tnf、mapk1、egfr、ccnd1和vegfa。

在分子对接验证部分，作者从pdb数据库下载靶蛋白晶体结构，使用pymol和autodock软件去除水分子和原始配体并加氢；从pubchem数据库下载中药核心成分的三维结构文件，使用autodock tools 1.5.6软件添加原子电荷、分配原子类型，并将所有柔性键设为可旋转，运行autodock vina进行分子对接。选取ar、akt1、tp53以及关键通路核心靶点hif-1α、jak2、stat3与益肾胶囊主要活性成分进行对接。60个对接结果中57个显示较好的结合活性（结合能低于−1.2 kcal/mol），其中β-谷甾醇（β-sitosterol）与核心靶蛋白结合最佳，tp53是与益肾胶囊关键化学成分结合活性最好的靶蛋白。例如，芒柄花素（formononetin）通过氨基酸残基asn-231和tyr-229与akt1形成氢键，通过arg-174形成pi-alkyl相互作用；毛蕊异黄酮（calycosin）通过gln-96与hif-1α形成氢键，通过tyr-98形成pi-pi堆叠作用。分子对接结果表明益肾胶囊关键化学成分与疾病关键靶点具有良好的结合活性。

在实验验证部分，作者进行了动物实验和细胞实验。动物实验中，40只spf级健康雄性sd大鼠随机分为10只用于制备含药血清，其余30只随机分为正常对照组（n组，10只）和模型组（20只）。模型组大鼠在左肾切除后腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, stz, 50 mg/kg）诱导糖尿病肾病，造模成功后随机分为糖尿病肾病组（dn组）和益肾胶囊组（ys组）。ys组给予益肾胶囊灌胃液1.25 g/kg/d灌胃，n组和dn组给予等量生理盐水灌胃，连续8周。治疗结束后收集大鼠右肾标本进行病理学检查、免疫组化和western blotting检测。细胞实验中，大鼠肾小管上皮细胞（nrk-52e）分为正常组（5.5 mmol/l葡萄糖）、高糖组（30 mmol/l葡萄糖）和益肾含药血清治疗组（30 mmol/l葡萄糖+10%益肾含药血清），培养24小时后收集细胞蛋白进行western blotting检测。病理学检查采用he、pas和masson染色观察肾组织病理变化，免疫组化检测hif-1α、jak2和stat3的表达，western blotting检测hif-1α、jak2、stat3、tgf-β和mcp-1蛋白表达水平，并采用spss 22.0软件进行统计分析。

研究结果显示，在网络药理学层面，益肾胶囊治疗糖尿病肾病的主要活性成分为槲皮素、山柰酚、没食子酸和黄芪甲苷iv等，关键靶点包括ar、akt1、tp53、esr1和jun等，重要信号通路包括age-rage、hif-1和jak-stat等。分子对接结果显示大多数靶点与益肾胶囊成分具有良好的结合活性。在动物实验中，he染色显示dn组大鼠肾小球毛细血管袢肥大、基底膜增厚、系膜细胞和系膜基质增生、肾小管上皮细胞肥大，而ys组上述病变有不同程度减轻。pas染色显示dn组肾小球系膜区和肾小管上皮细胞可见pas阳性蛋白沉积，ys组pas阳性蛋白沉积减少。masson染色显示dn组肾小球体积增大、肾小管上皮细胞明显水肿、管腔变窄，可见蓝染胶原组织，而ys组肾小管上皮细胞水肿减轻、蓝染胶原组织减少。免疫组化结果表明，n组肾组织中hif-1α有少量表达，dn组hif-1α表达高于n组，而ys组hif-1α表达较dn组进一步升高（p<0.05）；jak2和stat3在n组有少量表达，dn组表达高于n组，ys组表达较dn组降低（p<0.05）。western blotting结果显示，高糖刺激24小时后，nrk-52e细胞和肾组织中hif-1α、jak2、stat3、tgf-β和mcp-1蛋白表达均较正常组升高（p<0.05）；经益肾胶囊治疗后，hif-1α表达进一步升高（p<0.05），而jak2、stat3、mcp-1和tgf-β表达均降低（p<0.05）。上述结果表明，益肾胶囊可干扰hif-1α和jak/stat信号通路，减少糖尿病肾病大鼠肾组织的炎症和纤维化损伤。

本研究得出的结论是，益肾胶囊在治疗糖尿病肾病中具有多成分、多靶点、多通路的特征。网络药理学分析揭示了益肾胶囊的关键活性成分、核心靶点和主要信号通路，分子对接证实了这些成分与靶点之间的良好结合活性。进一步的体外和体内实验证实，益肾胶囊通过上调hif-1α表达、抑制jak2/stat3信号通路，降低mcp-1和tgf-β的表达，从而减轻糖尿病肾病大鼠肾组织的炎症和纤维化损伤。该研究为益肾胶囊治疗糖尿病肾病提供了科学依据，也为进一步探索其潜在机制提供了新的方向。

本研究的亮点在于，将网络药理学预测与分子对接验证及体外体内实验验证有机结合，形成了从“成分-靶点-通路”预测到生物学实验验证的完整研究链条。研究发现益肾胶囊在高糖环境下进一步上调hif-1α表达，同时抑制jak2/stat3通路，这一双向调节作用提示hif-1α的激活可能通过促进自噬等机制发挥肾脏保护作用，为理解益肾胶囊的作用机制提供了新的视角。此外，研究还发现β-谷甾醇与核心靶蛋白结合最佳，tp53是与益肾胶囊关键化学成分结合活性最好的靶蛋白，这些结果为后续单体成分研究和中药配伍机制研究指明了方向。