学术报告

研究作者与发表背景

这篇研究题为《Genome-wide CRISPR screen identifies RACK1 as a critical host factor for flavivirus replication》，由Byron Shue、Abhilash I. Chiramel、Berati Cerikan等多位作者联合完成。作者分别隶属于阿德莱德大学传染病研究中心、美国国家卫生研究院 (NIH) 洛矶山实验室以及德国海德堡大学传染病学系等机构。研究发表于2021年的《Journal of Virology》。

研究背景及目标

黄病毒（Flavivirus）是由节肢动物传播的RNA病毒，并且包含多个能导致全球性传染病的病毒种类，例如寨卡病毒（ZIKV）、登革热病毒（DENV）和西尼罗河病毒（WNV）。黄病毒的致死率和发病率显著，但针对其的有效抗病毒疗法和疫苗仍然匮乏。黄病毒的生命周期完全依赖于宿主细胞因子的配合，因此，识别关键的宿主因子对于理解病毒的复制机制和开发治疗策略至关重要。

本研究旨在通过CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选技术，识别与寨卡病毒复制相关的宿主基因，从而揭示在多种黄病毒复制过程中起重要作用的宿主关键因子。研究还重点探讨了关键因子RACK1（Receptor for Activated C Kinase 1）在黄病毒和其他病毒（如SARS-CoV-2）复制过程中的作用机制。

研究流程

本研究包括以下几个主要流程：

1. 全基因组CRISPR筛选

研究团队在人肝癌细胞系Huh7.5中进行全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选，利用lentiCRISPRv2-GECKO库将sgRNA引入细胞中。筛选步骤包括以下具体环节： - 细胞以被动病毒感染方式转导GECKO库，随后通过嘌呤霉素（puromycin）进行阳性筛选。 - 转染的细胞群暴露于高剂量的寨卡病毒株（MR766），在感染诱导细胞死亡（CPE）后的幸存细胞中提取基因组DNA。 - 使用下一代测序技术分析CRISPR筛选目标基因，通过DESeq2和MAGeCK算法确定显著富集的基因。

筛选中发现，EMC（Endoplasmic Reticulum Membrane Complex）多个亚基基因（EMC1、EMC5、EMC6）显著富集，而RACK1（GNB2L1）是筛选中富集水平最高的基因。

2. 候选基因验证

通过单独敲除EMC1、EMC6和RACK1，用qPCR和病毒斑块实验验证这些基因对寨卡病毒复制的影响。实验结果显示，RACK1敲除显著降低了寨卡病毒RNA的积累以及病毒颗粒的产生。

3. siRNA敲低实验

为确认RACK1作用的重要性，团队通过小干扰RNA（siRNA）敲低RACK1表达，并在不同细胞系（如Hela和胎盘来源Htr8细胞系）中进一步验证。结果同样表明RACK1在黄病毒（包括非洲和亚洲系ZIKV株）感染中的关键作用。

4. 扩展性研究：RACK1与其他病毒的关系

研究进一步探讨RACK1是否支持其他病毒的复制。实验涵盖多种黄病毒（DENV、WNV等）和其他类型病毒（如SARS-CoV-2、VSV、EBOV和HSV）。结果显示，大多数黄病毒和SARS-CoV-2的复制依赖于RACK1，但并非所有病毒，例如黄热病疫苗株YFV17D无此依赖。

5. RACK1在病毒生命周期中的机制研究

研究采用登革热亚基因组克隆（DENV sub-genomic replicon）系统分析RACK1在病毒生命周期中发挥作用的阶段。实验表明，RACK1主要在病毒RNA复制前的阶段起作用，而不影响病毒进入或初期mRNA翻译。此外，通过PLIRO（Plasmid Induced Replication Organelle）模型，研究发现RACK1参与了病毒复制小体（replication vesicle packets, VPs）的生成，敲低RACK1会导致VP数量显著减少，并影响内质网膜的重构和病毒复制复杂的形态。

6. 与黄病毒NS1的相互作用研究

研究还探讨了RACK1与黄病毒关键蛋白NS1的潜在关系。通过免疫共沉淀实验及荧光显微镜检测，研究发现RACK1与多种黄病毒NS1存在直接相互作用，并在病毒复制小体的形成中协同发挥作用。

研究主要结果

1. RACK1是黄病毒的重要宿主因子
   CRISPR筛选及后续验证确认RACK1在寨卡病毒及其他大多数黄病毒的复制过程中扮演重要角色。

2. RACK1的病毒特异性依赖性
   不是所有病毒都依赖RACK1，如SARS-CoV-2（与黄病毒类似的正链RNA病毒）依赖于RACK1，而负链RNA病毒（如EBOV）和DNA病毒（如HSV）则不依赖。

3. RACK1的功能定位
   RACK1不影响病毒进入宿主细胞或初期翻译，而是在病毒RNA复制和病毒复制小体的形成中发挥关键作用。

4. RACK1与NS1蛋白的相互作用
   RACK1通过与NS1的接触，可能为内质网膜构建病毒复制小体提供框架或调节信号。NS1蛋白局部分布和病毒复制中间体dsRNA的定位都受到RACK1的显著影响。

研究结论与科学及应用价值

本研究系统揭示了RACK1在黄病毒及SARS-CoV-2感染中的核心作用，并提出了RACK1可能通过其与NS1的直接相互作用和宿主内质网重构机制来影响病毒复制。以下几个方面体现了研究价值： - 科学价值：提供了病毒与宿主因子相互作用的深入机制，使科学家更好地理解黄病毒生物学乃至RNA病毒感染模式。 - 应用价值：RACK1是潜在的广谱抗病毒靶标，可用于开发针对多种黄病毒（例如寨卡病毒和登革病毒）的治疗策略和药物筛选模型。

研究亮点

• 方法学新颖性：首次利用PIRO表达模型发现RACK1影响黄病毒复制复杂生成的具体作用。
• 广泛适应性：RACK1在多种病毒感染中的核心地位使其成为病毒生物学研究的重点。
• 交叉价值：研究揭示了黄病毒与冠状病毒（如SARS-CoV-2）在宿主依赖机制中的相似性，为未来研究提供了方向。

总结

本研究通过全基因组CRISPR筛选确认了RACK1是黄病毒RNA复制和内质网膜重构的重要因子。研究清晰描绘了RACK1与病毒关键蛋白NS1的相互作用联系以及其在病毒生命周期各步骤的作用。相关发现为未来开发广谱抗病毒治疗提供了关键理论依据，并为病毒复制机制的进一步研究奠定了坚实基础。